Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия ДСН додецилсульфат натрия
ДТАБ додецилтриметиламмонийбромид ДТНБ дитионитробензоат ДТТ дитиотреитол
ДТЭ дитиоэрнтреитол ДФФ диизопропилфторфосфат ДЭФХ
диэладоилфосфатидилхолин ИНТ 2-"-иодофенил-3-п-нитрофенил-5-фенил-2Н-
тетразо-лийхлорид
ККМ критическая концентрация мицеллообразования НФК N-1-нафтилфталамовая
кислота НФМ непрерывный флуоресцентный микрофотолиз ПВП
поливинилпирролидон ПОФХ пальмитоилолеилфосфатидилхолин ПХ пероксидаза
хрена ПЭГ полиэтиленгликоль СЖХБ скоростная жидкостная хроматография
белков ТИД 3 трифторметил-3-(,и иодофенил)диазирин ТСХ тонкослойная
хроматография ТФУ трифторуксусная кислота ФХ фосфатидилхолин ФМСФ
фенилметилсульфонилфторид ЦТАБ цетилтриметиламмонийбромид ЭДТА
этплендиаминтетрауксусная кислота CHAPS 3-[ (З-холамидопропил)-
днметиламмоннй]-1-пропан-сульфонат (от англ. 3[ (3-cholamidopropyl)-
dimethy-lammonio] 1-propanesulphonate)
DMEM среда Игла в модификации Дульбекко HEPES ЙД-гидроксиэтилпиперазин-
И'Д-этансульфоновая кислота (от англ. N-2-hydroxyethylpiperazine-N/-2-
ethanesulphonic acid)
12
Список сокращений
MEM минимальная среда Игла
MES 2- (]\Г-морфолино)этансульфоновая кислота (от англ. 2-(N-
morpholino)ethancsulphonic acid)
MOPS 3-(И-морфолино)пропансульфоновая кислота (or англ. 3-(N-
morpholino)propanesulphonic acid)
PBS солевой раствор, забуференный фосфатом PIPES 1,4-
пиперазинэтансульфоновая кислота (от англ. pi-perazine-N,N/-bis-2-
ethanesulphonic acid)
TES И-трис(гидроксиметил) метил-2-аминоэтансульфоно-вая кислота (от англ.
N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesuIphonic acid)
ГЛАВА 1
ОРГАНЕЛЛЫ И МЕМБРАНЫ ЖИВОТНОЙ КЛЕТКИ
У. Говард Эванз
1. Введение
Мембраны животных клеток либо ограничивают морфологически различимые
органеллы со строго определенными функциями, либо образуют ретикулярные
или везикулярные структуры в цитоплазме. Из животных клеток, имеющих
ядро, выделено и биохимически охарактеризовано около 10 типов мембран. К
концу 60-х годов были получены и биохимически охарактеризованы все
основные мембраны и органеллы; в первую очередь это касалось клеток
печени. С помощью морфометрических измерений [1] были установлены их
относительные площади и объемы. Тем не менее анализ безъядерных
гомогенатов печени с помощью зонального центрифугирования в градиенте
плотности сахарозы показал, что довольно много мембранных белков все еще
остаются неидентифицированными. Стало ясно, что аппарат Гольджи
неоднороден (2], особенно в транстубулярном направлении [3], а
плазматическая мембрана клеток in situ [4, 5] и в культуре [6, 7]
обладает функциональной мозаичностью. Идентификация окаймленных мембран и
исследование сложного разветвленного эндоцитозного компартмента [8]
способствовали тому, что удалось функционально охарактеризовать если не
все, то большинство клеточных мембран.
В этой главе мы в основном рассмотрим стратегию выделения мембран
животных клеток и определение их свойств. Более полную информацию можно
найти в специальных монографиях [9] или оригинальных статьях, на которые
мы ссылаемся в этой главе. Методы выделения и характеристики мембран и
органелл растительных клеток, в принципе аналогичные таковым для клеток
животных, изложены в гл. 2.
2. Методы выделения
2.1. Недеструктивные методы
2.1.1. Высвобождение мембранных везикул
Эта группа методик основана на получении фрагментов, отделяющихся от
поверхности клетки, как правило в виде везикулярных структур. Клетки,
особенно опухолевые [10], спонтанно
14
Глава 1
высвобождают в среду микровезикулы, происходящие из плазматической
мембраны. Например, от лейкозных клеток отделяются везикулы, обогащенные
опухолевыми антигенами [11], клетки мастоцитомы высвобождают антигены Н-2
[12], от рети-кулоцитов отделяются везикулы, содержащие рецепторы транс-
феррина [13], а от клеток А-431 -везикулы, содержащие рецепторы фактора
роста эпидермиса,- киназные комплексы [14]. Отделение микровезикул,
обогащенных маркерными компонентами плазматической мембраны, можно
индуцировать с помощью разнообразных химических агентов. Так, в монослоях
фибробла-стов и в миобластах происходит отделение везикул от
плазматической мембраны при инкубации клеток от 15 мин до 2 ч в без-
белковой среде, содержащей 25 мМ формальдегид +2 мМ ди-тиотреитол (ДТТ)
или 10 мМ N-этилмалеимид [15]. Лимфоциты, инкубируемые в присутствии
колхицина или цитохалазина, высвобождают везикулы, содержащие IgM и IgD
[16]. При инкубации эритроцитов в среде с ЭДТА-СаС12 от них отделяются
без гемолиза везикулы, обедненные актином и спектрином [17]; тромбоциты
также высвобождают везикулы в присутствии небольшого количества
детергента, например дилаурилглицерол-фосфохолина (Sigma) [18]. От
изолированных гепатоцитов, находящихся в солевой среде, после скоростного
центрифугирования отделяются везикулы, происходящие в основном из
плазматической мембраны [19]. Мембранные фрагменты могут отделяться не
