Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
PBS.
3. Добавляют по 30 мкл раствора РСБ в пробирки комплекта 3
(неспецифическое связывание).
4. Добавляют по 20 мкл мембранного солюбилизата в пробирки комплектов 1 и
3.
5. Добавляют по 20 мкл буфера для солюбилизации в пробирки комплекта 2.
6. Инкубируют все пробирки при 22 °С в течение 15 мин.
7. Охлаждают их во льду и затем добавляют во все пробирки по 50 мкл
охлажденного раствора ^-глобулина.
8. Добавляют по 100 мкл раствора ПЭГ (удобно использовать для этого
эппендорфовскую мультипипетку).
9. Перемешивают на вортексе. Выдерживают во льду в течение 20 мин и затем
центрифугируют при 12 000g в течение 8 мин на центрифуге типа
Microcentaur.
10. Наслаивают на инкубационную смесь охлажденный во льду дибутилфталат
почти до верха пробирок.
11. Центрифугируют в течение 2 мин в условиях, указанных выше, и затем
осторожно отсасывают водный супернатант и лежащий под ним масляный слой.
12. Отрезают у пробирок донышко с осадком и определяют радиоактивность на
подходящем у-счетчике.
13. Рассчитывают уровень специфического связывания так, как описано выше.
Литература
1. Booth A. G., Olanlyan R., Vanderpuye О. А. (1980). Placenta, 1, 327.
2. Cuatrecasas P. (1972). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 318.
ПРИЛОЖЕНИЕ IV
РЕАГЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ
Ниже перечислен ряд реагентов, модифицирующих белки, которые можно
использовать в мембранных исследованиях, но которые пока не нашли такого
применения (гл. 6, разд. 6 и табл. 6.4).
Реагенты, кото- Лите-
Амино- рые могут про- Непроннкающие Условия н пояснения
кислота никать через мембрану реагенты ратура
Аргннин 2,3-Бутанднон pH 7-8, 100-кратный мольный избыток, 25
°С, 1 ч. Может осуществлять модификацию по аминогруппам Г1]
Камфохинон- pH 9, 37 °С. до 24 ч, Г2]
10-сульфоно- реакция обратима
вая кислота
Циклогексан- pH 9, 35 °С. 2 ч [31
дпон-1,2 pH 9, 30 3С, 30 мин
л-Гидрокси- и [41
п-ннтрофе-
ннлглпоксали
Аспара- Бис-(1,1-три- До сих пор использо- [51
гин фторацеток- си)-нодбен- зол вался только при анализе
аминокислотного состава
Цистеин 5,5'-Дитиобис-(2-ннтробен-зойная кислота) (реак- pH
7,3, 25 °С, мкМ, 1 ч [61
тив Эллмана) pH 8.0, 25-50 °С, из-
Ы-(иодфенил)- [7]
трнфтораце- быток по иотям до
тамид 50 раз. В результате образуются свободные аминогруппы
Реагенты, используемые для модификации белков
401
Продолжение
Амино-
кислота
Реагенты, которые могут проникать через мембрану
Непроникающне
реагенты
Условия и пояснения
Лите-
ратура
Глута-
мин
Лизин
Серии/
Трео-
нин
Трипто-
фан
Тирозин
Метил- (3,5-ди-иод) - и метил- (л-гид-рокси)-бен-зимидаты (реагент Вудса)
2-Иминотнолаи (реагент Траута)
о-Фталевый альдегид
Уксусный/Янтарный ангидриды
4-Хлор-7-суль-фобеизофу-раиаммоний (СБФ-хло-рид) Бис-(1,1-три-фторацеток-
си) -нодбен-
Ангидрид эток-симуравьиной кислоты я-Нитробеизол-сульфонил-хлорид
pH 8,0, 37 °С. 4 ч,
мкМ; флуоресцирует, реакция обрати-via в присутствии 2-меркаптоэтанола
Как для аспарагина
pH 8,0-9,0, 25-37 °С, мкМ; степень модификации со временем растет
Отдает свободные ти-ольные группы, поэтому может использоваться как
перекрестносшиваю-щий реагент. pH 8,0, мМ, 4-25 °С, 1 ч pH 9,0-10,5, до
10 мМ, 10-50 °С, до 10 мин, для образования флуорофора требуется 2-
черкап-тоэтанол Не селективны
Реагирует также с His, Lys, Ser и Туг
pH 7-8, 25 °С, 1 мМ, 30 мин
[81
[51
[9]
[10]
[121
[131
[14]
[151
Литература
1. Yankeelov J. A. Jr. (1972). Methods Enzymol., 25, 566.
2. Patide С. S., Pelzig М., Glass J. D. (1980). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 896.
3. Patthy L" Smith E. L. (1975). J. Biol. Chem., 250, 557.
402
Приложение IV
4. Yamasaki R. В., Shimer D. A., Feeney R. E. (1981). Analyt. Biochem.,
Ill,
220.
5. Soby L. М., Johnson P. (1981). Analyt. Biochem., 113, 149.
6. Riddles P. W., Blakeley R. L., Zerner B. (1979). Analyt. Biochem.,
94, 75.
7. Schwartz W. E" Smith P. K., Royer G. P. (1980). Analyt. Biochem.,
106., 43.
8. Andrews J. L" Ternal B" Whitehouse M. W. (1982). Arch. Biochem.
Biophys., 214, 386.
9. Bright G. R., Spooner B. S. (1983). Analyt. Biochem., 131, 301.
10. Birnbaumer М. E.. Sehrader W. T" O'Malley B. W. (1979). Biochem. J.,
181, 201.
11. Lambert J. М.. Baileau G., Cover J. A., Traut R. R. (1983).
Biochemistry, 22 3913
12. Benson J. R., Hare P. E. (1975). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72,
619.
13. AHen G., Harris J. I. (1976). Eur. J. Biochem., 62, 601.
14. Tsurushiin S., Hirawatsu. A., Inamatsu М., Yasunolsu К. T. (1975).
Biochim,
Biophys. Acta, 400, 451.
15. Liao Т. Н., Ting R. S., Yeung J. E. (1982). J. Biol. Chem., 257,
5637.
ПРИЛОЖЕНИЕ V
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ СО СДВИГОМ ЗАРЯДА
Интегральные мембранные белки, по-видимому, содержат протяженные
гидрофобные участки, которые облегчают их встраивание в липидный бислой.
При солюбилизации в недена-турирующих условиях с этими участками
связывается детергент, и эта особенность используется при электрофорезе
со сдвигом заряда. Поскольку детергенты могут быть нейтральными,
