Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
3.1.3.5
3.4.11.1
2.3.2.^2
3.1.3.9
1.6.2.4
3.3.2.3
2.4.1.38
2.4.99.1 3.6.1.22
1.3.99.1
1.9.3.1
1.6.99.1
1.4.3.4
1.14.13.9
3.1.3.2 3.2.1.31
3.1.6.1
3.6.1.3
1.11.1.6
2.3.1.21
1.1.1.22
Детальное описание методов определения ферментативной активности можно
найтя в приведенных ссылках, а многие из методик описаны в работе [9].
Характер распределения активности в базолатеральной и апикальной областях
плазматической мембраны обсуждается в работе [4], указанной в гл. I.
Ферментных маркеров, специфичных для цис-области аппарата Гольджн, не
существует. Дальнейшие подробности и обсуждение вопросов, касающихся
надежности использования этих маркеров, см. в гл. 1 н 2.
Ферментные маркеры субклеточных фракций
395
Литература
1. Hardman I. С., O'Malley В. W. (1974). Methods Enzymol. 38С, 49.
2. Avruch J., Wallach D. F. H. (1971). Biochim. Biophys. Acta, 233, 334
3. Hubbard A. L" Wall D. A., Ma A. (1983). J. Cell Biol., 96, 217.
4. Chatterjee S. K-, Battacharya M" Barlow I. J. (1979). Anal. Biochem.,
95, 497.
5. Ipata P. L. (1967). Anal. Biochem., 20, 30.
6. Goldbarg J. A., Rutenberg A. M. (1958). Cancer, 11, 283.
7. lnoue M. S., Horiuchi S., Morino У. (1977). Eur. J. Biochem., 73, 335.
8. Aronson N. N.. Touster O. (1974). Methods Enzymol., 31, 90.
9. Sottocasa G. L" Kuylenstierna B., Ernster L" Bergstrand A. (1967). J.
Cell Biol., 32, 415.
10. Galteau М. М., Antoine B" Reggio H. (1985). EMBO J., 4, 2793.
11. Vischer P., Reutter W. (1978). Eur. J. Biochem., 84, 363.
12. Bergeron I. J. М.. Ehrenreich I. H., Siekevitz P., Palade G. E.
(1973). J. Cell Biol., 59, 73.
13. Navas P., Minnifield N., Sun /., Morre D. J. (1986). Biochim. Biophys
Acta, 881, 1.
14. Earl D. C. N.. Korner A. (1965). Biochem. J., 94, 721.
15. Sun F. F., Crane F. L. (1969). Biochim. Biophys. Acta, 172, 417.
16. Fleischer S., Fleischer B. (1967). Methods Enzymol., 10, 427.
17. Schnaitman C., Erwin V. G., Greenawalt I. W. (1967). J. Cell Biol.
32,
719.
18. Hayashi O. (1962). Methods Enzymol., 5, 807.
19. Gianetto R., de Duve C. (11955). Biochem. J., 59, 433.
20. Chang P. L" Rosa N. E" Davidson R. G. (1981). Anal. Biochem., 117,
382.
21. Saermark Г., Flint N.. Evans W. H. (1985). Biochem. J., 225, 51.
22. Gierow P., lergil B. (1980). Anal. Biochem., 101, 305.
23. Thompson J. F., Nance S. L., Tollaksen S. L. (1978). Proc. Soc. Exp
Biol.
Med., 157, 33.
24. Markwell М. A. K-, McGroarty E. J., Bieber L. L" Tolbert N. E.
(1973). J. Biol. Chem., 248, 3426.
25. Neilands J. (1955). Methods Enzymol., 1, 449.
26*
ПРИЛОЖЕНИЕ III
АНАЛИЗ РЕЦЕПТОРОВ
А. Сивапрасадарао, Джон Б. Финдлей
1. Мембраносвязанные рецепторы
Анализ мембраносвязанных рецепторов обычно проводят, инкубируя клетки или
мембраны с радиоактивно меченным лигандом до установления равновесия и
затем отделяя свободный лиганд от связанного. Для этого используют целый
ряд методов, в том числе фильтрование (через стеклянные,
целлюлозноацетатные, нейлоновые, тефлоновые фильтры и центрифугирование).
Клетки и мембраны остаются на фильтре или осаждаются центрифугированием;
их затем тщательно промывают для удаления избытка лиганда (при условии,
что константы диссоциации комплекса рецептор - лиганд ниже 10-7 М). Чтобы
определить уровень неспецифического (без насыщения) связывания, проводят
параллельную инкубацию с 200-600-кратным избытком (по молям) немеченого
лиганда. Фильтрование позволяет быстро проводить анализ. Этот метод дает
надежные результаты при условии, что связывание радиоактивно меченного
лиганда с самим фильтром невелико по сравнению с его связыванием с
мембранами и что промывание не приводит к существенной диссоциации
комплекса лиганд - рецептор. Достаточно эффективно и центрифугирование
клеток и мембран, особенно если отделение свободного лиганда от
связанного проводить с использованием несмешивающегося с водой масла. Эта
процедура дает ряд преимуществ. Во-первых, отпадает необходимость в
промывании осадка, поскольку фон сразу является достаточно низким; во-
вторых, быстрота этого процесса позволяет измерять связывание в случае
быстро диссоциирующих систем рецептор - лиганд.
Чтобы обеспечить количественный выход клеток или мембран после
центрифугирования, необходимо подобрать такое масло, которое имеет
плотность, промежуточную между плотностью клеток и водной среды. Масляные
среды с различной плотностью можно получить, смешивая в разных
соотношениях фта-латные эфиры коротких (цепочка из 2-4 углеродных атомов)
и длинных (8-9 атомов) алифатических спиртов. Обычно аликвоту
инкубационной смеси наносят сверху на слой масла и затем центрифугируют.
Часто проводят инкубацию репептора с лигандом непосредственно на
поверхности слоя масла. Ниже описана методика определения рецептора для
ретинолсвязы-вающего белка (РСБ) плазмы крови. Эту методику легко
приспособить для анализа многих других рецепторных систем.
Анализ рецепторов
397
1.1. Реагенты
[1251]-РСБ: 0,5 нмоля РСБ иодируют посредством Na[I25I]
