Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
мембран эритроцитов человека с монослоями из фосфатидилсерииа мозга быка
И) и яичного фосфатидилхолина (?) на границе раздела фаз воздух - вода:
зависимость увеличения поверхностного натяжения Ал, обусловленного
добавлением белка, от исходного поверхностного натяжения яь Светлые
кружки- полипептид полосы 1, темные - полипептид полосы 2. Начальная
концентрация белка в субфазе 7,5 мкг/мл. Взаимодействие имеет
физиологический смысл, только когда лпредельное значение ni, при котором
Дя=0, больше 31 мН/м. Этому условию удовлетворяет лишь пара
фосфатидилсерин - белок полосы 2. (Из работы [114] с разрешения авторов.)
Биофизические подходы
383
систем встречается с двумя серьезными трудностями. 1. Обнаруженная в
функциональных тестах специфичность данного липида может объясняться не
тем, что этот липид нужен для работы белка, а тем, что без него
выделенный белок не встраивается в липидный бислой [121]. Аналогично
любые изменения конформации белка, наблюдаемые при реконструкции, могут
быть связаны не с природными белково-липидными взаимодействиями, а с
восстановлением под действием липида нативной конформации белка, частично
денатурированного в ходе выделения. 2. Происходящие при связывании белка
с липидным бислоем спектральные изменения, особенно изменения спектра
флуоресценции и кругового дихроизма в ближней УФ-области, вовсе не
обязательно обусловлены конформационными перестройками. Они могут
объясняться просто изменением полярности окружения.
5.3. Влияние белка на структуру и подвижность липидов
Согласно имеющимся экспериментальным данным, мембранные белки могут
влиять на мембранные липиды следующим образом:
1) изменять молекулярную упорядоченность и ограничивать подвижность
аннулярных липидов;
2) аналогичным образом изменять "вторичные" липидные слои, соседние с
аннулярными;
3) вызывать изменения упорядоченности и характера низкочастотных движений
всей липидной фазы;
4) индуцировать разделение фаз в липидном бислое;
5) индуцировать или стабилизировать асимметрию бислоя.
5.3.1. Подвижность аннулярных липидов
Подвижность аннулярных липидов лучше всего исследовать с помощью ЭПР
спин-меченных липидов, о чем уже говорилось в разд. 5.1.1.
5.3.2. Липиды, прилегающие к аннулярному слою
Свойства липидов в областях, прилегающих к аннулярному слою, можно
попытаться исследовать калориметрическими методами. Например, с помощью
высокочувствительной дифференциальной сканирующей калориметрии Са2+-
АТРазы сарко-плазматического ретикулума, встроенной в везикулы из фосфа-
тидилхолина, удалось выявить три типа дополнительных пиков теплоемкости,
один из которых был приписан "вторичным" доменам с нарушенной упаковкой
липидов. Аналогичные резуль-
384
Глава 8
таты можно получить, измеряя анизотропию флуоресценции ди-
фенилгексатриена или сходных флуоресцентных меток, введенных в липид
[122]. По-видимому, в более ранних работах авторам с помощью
дифференциальной сканирующей калориметрии не удалось разделить эти
вторичные домены и аннуляр-ные липиды, поэтому они получили завышенное
значение количества аннулярных липидов по сравнению с данными ЭПР (см.
разд. 5.1.1).
5.3.3. Упорядоченность и низкочастотная подвижность фосфолипидов
суммарной липидной фазы
О влиянии белков на липиды, не входящие в аннулярный слой или "вторичные"
домены, можно судить, следя за изменениями спектров ЭПР спин-меченных
липидов или спектров 2Н-ЯМР дейтерированных липидов. В первом случае для
этого сравнивают "подвижный" спектральный компонент белково-липидной
системы (разд. 5.1.1) и спектр чистого липида [66, 101, 123], а во втором
- сигнал (уширенный) белково-липидной системы с сигналом чистого липида
[43, 44]. В случае ЭПР "подвижный" компонент спектра может содержать
вклад липидов "вторичных" доменов, а в случае ЯМР в сигнал дают вклад
липиды и аннулярного слоя, и "вторичных" доменов. Тем не менее оба метода
позволяют оценить подвижность и упорядоченность суммарной липидной фазы
[43, 66, 101, 123-125].
Недавно сообщалось об успешном применении метода деполяризации
флуоресценции для изучения взаимодействия белков и липидов на
относительно больших расстояниях [126]. В основе метода лежит эффект
тушения флуоресценции погруженной в липидную фазу метки вследствие
переноса энергии на окружающие молекулы белка, содержащие подходящий
акцептор. Определяемый из конечного значения анизотропии флуоресценции
метки параметр упорядоченности липидов (разд. 3.2.3) не зависит от
ближайшего окружения белка, т. е. он отражает подвижность липидов,
находящихся снаружи от аннулярного слоя, и "вторичных" доменов [126].
5.3.4. Фазовое разделение липидов
Индуцируемое белками латеральное разделение фаз в липидном бислое можно
изучать теми же методами, что и в чистых липидных системах (разд. 3.3).
Кроме того, весьма информативным бывает метод 31Р-ЯМР: мембранные белки
могут индуцировать образование в бислое областей, включенных в
гексагональную фазу [127], или, наоборот, включенных в бислой доменов
