Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
связанную с липидом молекулу соответствующего флуорофора либо, наоборот,
тушение флуоресценции меченого липида из-за переноса энергии на связанный
с белком хромофор (спектр поглощения которого перекрывается со спектром
испускания флуорофора). Важная особенность данного подхода состоит в том,
что синглет-синглетный перенос энергии осуществляется эффективно даже в
тех случаях, когда расстояние между донором и акцептором превышает 70 А.
Этот метод идеально подходит для исследова-
Рис. 8.14. Спектры флуоресценции (зависимость интенсивности 1т от
волнового числа v) анилинонафтилспектрина в отсутствие липида (1) н в
присутствии фосфатидилсериновых липосом при концентрациях липида 0,095 мМ
(2); 0,185 мМ (3); 0,36 мМ (4); 0,53 мМ (5); 0,69 мМ (5) и 0,85-1,0 мМ
(насыщение) (7). Концентрация спектрина равна 0,2 мкМ; температура 30 °С.
Согласно этим данным, в насыщении на один димер спектрина приходится 1500
молекул фосфатидилсерина; константа связывания составляет 3-107 М-1.
Добавление фосфатидилхолииовых липосом к белку не вызывает никаких
изменений спектра флуоресценции меченого спектрина. (Из работы [110] с
разрешения авторов.)
Биофизические подходы
381
ния связывания растворимых периферических белков с липидным бислоем: если
флуорофор поместить на внутренней стороне бислоя, а значит, далеко от
центра связывания белка, можно свести к минимуму возможное влияние его на
белково-липидные взаимодействия. Применение метода описано в работах
[100- 112].
5.1.4. Другие методы
Специфичность белково-липидных взаимодействий в реконструированных
мембранных системах можно исследовать с помощью методов комбинационного
рассеяния и инфракрасной спектроскопии. Например, если белок встроить в
бислой, образованный смесью двух липидов, жирнокислотная цепь одного из
которых дейтерирована, то, определяя ширину соответствующих С-*H- и С-2Н-
колебательных полос, можно оценить величину относительного сродства белка
к этим липидам [113].
Ценные данные о специфичности взаимодействия периферических мембранных
белков с липидами дают исследования свойств липидного монослоя на границе
раздела фаз воздух - вода. Растворенный белок добавляют в водную субфазу
и регистрируют изменения поверхностного натяжения монослоя Дя,
обусловленные связыванием или частичный проникновением белка в липид. Дя
уменьшается при увеличении начального поверхностного натяжения яь
приложенного к монослою. Особенно важным параметром, характеризующим
взаимодействие, является предельное значение Яю, выше которого Дя равно
нулю. Зная эту величину, можно судить о характере взаимодействия в живых
системах [114]. Соответствующий пример представлен на рис. 8.15. Этот
метод требует наличия полностью свободного от детергента белка, поэтому
применять его к интегральным мембранным белкам можно только в том случае,
если последние могут быть выделены без детергента и при этом не
утрачивают природную способность связывать липиды [115].
Центры прочного связывания липидов на солюбилизированных, свободных от
детергента периферических или интегральных белках можно обнаружить,
изучая связывание методом равновесного диализа. При этом иногда
приходится использовать более растворимые в воде производные липидов
(например, дез-оксихолевую кислоту вместо эпикопростанола) [116].
В мембранах некоторых ауксотрофных бактерий, выращенных в присутствии
только одной жирной кислоты, или в реконструированных мембранных системах
часть липидных молекул может не участвовать в температурных фазовых
переходах. Зная размер такой фракции, можно определить число молекул
анну-лярных липидов, связанных с молекулой интегрального белка.
382
Глава 8
Полученная таким образом величина бывает обычно выше, чем найденная
методом ЭПР [117, 118] (см. также разд. 5.3).
5.2. Влияние липидов на структуру белка
Не вызывает сомнения, что специфическая укладка полипеп-тидных цепей всех
интегральных и некоторых периферических мембранных белков определяется и
стабилизируется окружающими липидными молекулами. Для" изучения этого
явления лучше подходят реконструированные, чем природные мембранные
системы, поскольку имеется возможность варьировать липидный состав.
Определение зависимости функциональных свойств белка от состава липидов -
это наиболее прямой и чувствительный способ изучения индуцируемых липидом
конфор-мационных изменений белка и их специфичности. Однако
функциональные изменения еще не дают представления о лежащих в их основе
структурных перестройках. Для изучения структурных изменений приходится
применять физические методы. Для этого пригодны любые методы,
чувствительные к изменениям структуры или динамики белков (разд. 2.4 и
2.5), например КД и флуоресцентная спектроскопия. Применение их к
аполипопро-теинам сыворотки описано в работах [119, 120].
Изучение индуцируемых липидами изменений структуры и функции белков с
помощью реконструированных мембранных
, МН/М
Рис. 8.15. Взаимодействие спектриновых полипептидов (полосы 1 и 2) из
