Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
контактирующих с белком. В реконструированных белково-липидных системах
эту оценку можно получить при различных соотношениях белок/липид, повысив
тем самым надежность интерпретации измеряемых спектров. Кроме того,
варьируя концентрацию спин-меченных липидов, можно определить
относительное сродство различных видов меченых липидов к данному белку, а
значит, оценить специфичность белково-липидных взаимодействий [100, 104].
Необходимо отметить, однако, что определяемое таким образом относительное
сродство представляет собой усредненную величину. Поскольку число молекул
аннулярных липидов на молекулу белка превышает для большинства систем 20-
60 [66, 100, 101, 105], можно не выявить в белке одного или нескольких
центров специфического связывания липидов с высоким сродством (см.,
например, работы [106, 107]).
Попытки определения размеров фракции мембранных липидов с ограниченной
подвижностью наталкиваются на две серьезные трудности.
1. Использование различных методов разложения спектра ЭПР на две
составляющие, соответствующие спектрам фракций липидов с ограниченной и
неограниченной подвижностями, может давать совершенно разные результаты
[100].
2. Независимо от метода оценки кажущиеся размеры фракций с ограниченной
подвижностью зависят не только от температуры (см. выше), но и от
положения спиновой метки в липидной молекуле. Кроме того, они могут
зависеть от гибкости меченых молекул фосфолипида [100].
5.1.2. ЯМР
С помощью ЯМР можно изучать более медленные процессы, чем с помощью ЭПР;
усреднение по ориентации ядерных спинов происходит за времена порядка 10-
4 с, а в случае ЭПР эта величина составляет 10~7 с. Поскольку липидный
обмен между ан-нулярным слоем и основным пулом липидов происходит
быстрее, чем за 10-4 с, ЯМР-спектры не позволяют выявить наличие двух
липидных субпопуляций с разной подвижностью, и получаемая картина
соответствует единой липидной популяции с усредненными характеристиками.
С другой стороны, благодаря способности регистрировать процессы с
характерными временами менее миллисекунды ЯМР позволяет обнаруживать и
исследовать субпопуляции, которые более прочно, а значит, и более специ-
Биофизические подходы
379
фично связаны с мембранными белками липидов, чем со "средним" аннулярным
липидом. Пока, однако, такая возможность используется недостаточно
широко; по-видимому, это связано с трудностями получения больших
количеств 2Н- или 13С-мечен-ных аналогов фосфолипидов, а также с
недостаточной чувствительностью метода.
5.1.3. Измерение флуоресценции
Естественная флуоресценция остатков триптофана и ковалентно "пришитых" к
белку меток может тушиться спин-мечен-ными или бромированными липидами
[9, 108, 109]. Поскольку такое тушение происходит, лишь когда расстояние
между флуоресцирующей группой и тушителем не превышает ~ 7 А, тушителем
могут быть прямо прилегающие к белку молекулы липида (т. е. часть
аннулярных липидов). Время жизни возбужденного состояния и триптофана, и
типичных экзогенных флуорофоров менее 10-7 с. Следовательно, обмен между
аннулярным слоем и всем липидным пулом почти не будет влиять на тушение
флуоресценции. Правда, это зависит от числа и положения флуоресцентных
групп в молекуле белка, а также от локализации групп-тушителей на
липидных молекулах. При изучении белково-липидных взаимодействий этим
методом лучше всего, по-видимому, в смесях меченых и немеченых липидов
определять эффективность тушения флуоресценции для нескольких
фосфолипидов с разными полярными головками, но одинаковыми
жирнокислотными цепями с ковалентно пришитыми к ним группами (группой)-
тушителями. Это позволит сразу определить относительное сродство
различных фосфолипидов к тем участкам белков, в которых локализованы
флуоресцентные группы, а также число окружающих флуорофор молекул липида.
Основное преимущество метода - высокая чувствительность, особенно когда
используются экзогенные хромофоры с долгоживущим возбужденным состоянием
[100, 108, 109].
Другой подход к исследованию белково-липидных взаимодействий заключается
в регистрации разгорания (или в некоторых случаях уменьшения)
флуоресценции белков из-за ассоциации их с липидами. Этот метод
используется в основном для изучения периферических мембранных белков.
Можно анализировать также связывание белка как с единичными молекулами
липидов, так и с липидными моно- и бислоями (везикулами). Константы
связывания и стехиометрию определяют из зависимости интенсивности
флуоресценции от концентрации белка [100, 110]. На рис. 8.14 приведен
пример использования флуоресценции для изучения взаимодействия спектрина,
основного белка цитоскелета мембраны эритроцитов, с липосомами из
фосфатидилсерина.
25*
380
Глава 8
Специфичность белково-липидных взаимодействий можно изучать также,
измеряя эффективность синглет-синглетного переноса энергии [9]. В этом
случае определяют увеличение интенсивности флуоресценции липида
вследствие переноса энергии от остатков триптофана белка на ковалентно
