Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
геля эта методика вообще непригодна [44, 87]. Таким образом, возможности
ЯМР довольно сильно ограничены.
Коэффициенты латеральной диффузии липидов оценивали также из зависимости
ширины линий спектра 31Р-ЯМР от вязкости растворителя [88]. При этом,
правда, вычисления приходилось проводить при довольно сильных допущениях.
4.4.4. Другие методы
Новая методика исследования латеральной диффузии липидов в плоских
мультислоях по постановке эксперимента напоминает ВФФ. Небольшой участок
ампулы с содержащим спин-меченные липиды образцом освещают двумя
последовательными импульсами света, вызывающими фотохимическую
инактивацию меток. За время между вспышками спин-меченные липиды
диффундируют из затемненной зоны в засвеченную. По уменьшению
интенсивности сигнала ЭПР после второй вспышки света определяют
коэффициент диффузии липидов [89]. Сообщалось, что этот метод обладает
довольно широкими возможностями и применим для оценки подвижности липидов
в широком интервале характерных времен.
Латеральную диффузию меченных флуорофором липидов можно изучать также с
помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС). По постановке
эксперимента этот метод в основном идентичен методу ВФФ, за исключением
того, что в ФКС применяется не обесцвечивание образца, а индуцируемая
лазером флуоресценция. При этом регистрируются спонтанные флуктуации
концентрации метки на микроскопических участках поверхности. Коэффициент
диффузии определяют с помощью анализа автокорреляционной функции
флуктуаций [90]. Эта методика неприменима для изучения медленной диффузии
(например, диффузии мембранных белков) и ограничивается исследованием
систематических флуктуаций. Тем не менее корреляционная спектроскопия с
успехом применяется для исследования черных липидных мембран или липидных
мультислоев в жидко-кристаллическом состоянии и в состоянии геля [91].
4.5. Трансбислойная диффузия липидов
При трансмембранной диффузии, или "флип-флопе", компоненты мембраны
переходят из одной половины липидного бислоя в другую. Такие "перескоки"
совершают молекулы жирных кис-
374
Глава 8
лот, фосфолипидов и холестерола, а также некоторых ионофоров пептидной
природы, например валиномицин, но не молекулы мембранных белков. Поэтому
далее мы будем говорить только о мембранных липидах.
Исследование флип-флоп-переходов липидных молекул наталкивается на
серьезную проблему, состоящую в том, что нужно уметь отличать "природные"
переходы от тех, которые могут индуцироваться в результате манипуляций с
мембранами в ходе эксперимента. Частота таких индуцированных переходов
может значительно превышать частоту природных флип-флопов, причем,
вероятно, их очень трудно предотвратить [92]. Вообще говоря,
предполагается, что результаты опытов, в которых получены меньшие
скорости трансмембранного перескока молекул липидов, ближе к истине, чем
те, в которых для той же системы получены большие скорости. Флип-флоп-
переходы можно изучать биохимическими методами (см. гл. 4 и работы [92-
94]); из биофизических методов используют ЭПР и ЯМР.
4.5.1. ЭПР спин-меченных липидов
Обычно эксперимент состоит в том, что спин-меченные липиды вводят
симметрично в мембраны замкнутых везикул или клеток, а затем делают
распределение асимметричным. Для этого либо восстанавливают с помощью
аскорбата метки, расположенные на наружной стороне мембраны (тем самым из
спектра исключаются линии радикалов, связанных с липидами наружного
монослоя мембраны) [95], либо разрушают метки на внутренней стороне с
помощью эндогенных клеточных восстанавливающих агентов [96]. Характерное
время флип-флоп-переходов определяют из кинетики последующих изменений
зарегистрированного вначале ЭПР-сигнала [95, 96]. К сожалению, полученные
таким способом результаты иногда оказываются весьма противоречивыми.
Например, характерное время флип-флоп-переходов спин-меченных аналогов
фосфатидилхолина в мембранах эритроцитов человека при одних и тех же
температурах варьирует по данным разных авторов от нескольких минут [68]
до более чем 4 ч [96]. Определенный вклад в эту вариабельность, вероятно,
вносит нарушение конфигурации липидов некоторыми спиновыми метками или
аскорбатом.
4.5.2. ЯМР
Исследование флип-флоп-переходов липидов методом ЯМР основано на
регистрации сигналов ядер, принадлежащих полярным головкам, в присутствии
не проникающих через мембрану "смещающих реагентов". Эти реагенты - в
основном парамаг-
Биофизические подходы
375
нитные катионы Dy3+ или Nd3+ - способны изменять напряженность
резонансного магнитного поля и в то же время приводить к уширению сигнала
тех ядер, с которыми они контактируют. Таким образом, добавление
"смещающего реагента" к замкнутым фосфолипидным везикулам изменяет
положение и форму ЯМР-сигналов полярных головок наружного монослоя
мембраны и не влияет на соответствующие сигналы от внутреннего монослоя.
Этот эффект широко применяют для изучения структуры мелких липидных
везикул методом 31Р- или 13С-ЯМР [97, 98]. 13С-ЯМР используют также для
