Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
анизотропного вращения такая калибровка невозможна, поэтому для опреде-
оо
1.0 Ю'В
а.д-ю'1
Ч
Рис. 8.10. Спектры ЭПР с переносом насыщения (вторая гармоника) для
гемоглобина, содержащего ковалентно связанную спиновую метку -
малеимидиитрок-сид - при разной ротационной подвижности белка. Сверху
вниз: преципитированный НЬ; НЬ в 90%-ном глицероле при - 12°С; НЬ в 80,
60 и 40%-иом глнцероле при 5°С. Слева от спектров указано время
вращательной корреляции (в секундах), вычисленное исходя из среднего
диаметра белка и вязкости растворителя. (Из работы [76] с разрешения
авторов.)
Биофизические подходы
369
ления времен корреляции приходится прибегать к компьютерному
моделированию спектров ЭПР. К сожалению, связь между спектральными
параметрами и типом движения метки в анизотропной среде значительно менее
очевидна и однозначна, чем для изотропного движения [66, 75]. Поэтому нам
представляется, что изучение вращения белков в мембранах методом ЭПР с
переносом насыщения пока может дать лишь качественные или в лучшем случае
полуколичественные результаты.
4.2. Вращательная диффузия липидов
Подвижностью могут обладать не только отдельные участки углеводородной
цепи фосфолипидной молекулы, но и молекула в целом. Так, она может
вращаться вокруг продольной оси (вращение твердого тела), а сама эта ось
может прецессировать относительно своего среднего положения [44, 50].
Описывать такие вращения для липидных систем в жидкокристаллическом
состоянии можно по-разному. Некоторые авторы предпочитают использовать
для этого вращательную изомерную модель, в которой движение твердого тела
представляет собой суперпозицию движений его частей [43]. В других
моделях, используя те же экспериментальные данные, движение твердого тела
и изомеризацию цепи рассматривают как независимые и одновременные
процессы. Поэтому для изучения вращательной диффузии липидов используют
те же экспериментальные подходы, которые описаны в разд. 3.4.1 и 3.4.2.
При температурах ниже температуры основного фазового перехода
фосфолипидных мембран транс-гош-изомеризация затруднена и, по-видимому,
происходят в основном движения липидной молекулы как целого. Эти
медленные движения лучше всего исследовать методом ЭПР с переносом
насыщения с использованием спин-меченных липидов [77, 78]. Методические
подходы и возникающие трудности здесь те же самые, что и при изучении
вращения белков (разд. 4.1.2).
Молекула холестерола в биологических мембранах ведет себя практически как
твердое тело (за исключением концевого сегмента алифатического "хвоста",
обладающего способностью перемещаться относительно стероидного ядра
[79]). В "жидком" липидном бислое (выше температуры фазового перехода)
характерное время движения молекул холестерола лежит в том же диапазоне,
что и для сегментов углеводородных цепей фосфолипидов, и для изучения
подвижности холестерола применяются те же методы, что и для изучения
подвижности сегментов фосфолипидных молекул: 2Н- и ,3С-ЯМР и обычный ЭПР
(разд. 3.4.1 и 3.4.2). Для исследования "твердого" бислоя (состояние
геля) можно использовать метод ЭПР с переносом на-
370
Глава 8
сыщения [78]. Как и для любых мембранных систем, интерпретация
экспериментальных данных осложняется анизотропией движения.
4.3. Латеральная диффузия белков
Для исследования латеральной диффузии белков в биологических мембранах
или искусственных бислоях используют практически один метод -
восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (ВФФ). Существуют и
варианты этого метода [например, флуоресцентный микрофотолиз (ФМ)].
Сначала белок ковалентно и - если это возможно - специфически метят
флуоресцентной меткой, обычно производными флуоресценна или родамина. За
объектом (как правило, это единичная клетка) наблюдают с помощью
флуоресцентного микроскопа. В наиболее широко используемом варианте
метода часть или весь флуорофор на небольшом участке мембраны
фотохимически разрушают (обесцвечивают) с помощью мощного импульса
лазерного излучения. Типичный размер обесцвеченного пятна - около 10 мкм.
Сразу после этого измеряют кинетику восстановления флуоресценции в
облученном участке благодаря диффузии молекул белка из соседних областей
мембраны. Для этого в обесцвеченном участке возбуждают флуоресценцию
посредством сильно ослабленного лазерного пучка (достаточно слабого,
чтобы не вызывать дальнейшего обесцвечивания), с помощью микроскопа
"собирают" свет, испускаемый при флуоресценции, и передают его на
фотоумножитель [68, 80, 81]. В разновидности метода, называемой
"непрерывный флуоресцентный микрофотолиз" (НФМ), обесцвечивание и
измерение диффузии производят одновременно, для чего интенсивность света
поддерживают на постоянном промежуточном уровне [80-82].
Обработка результатов, полученных методом ВФФ, значительно более проста,
чем методом НФМ. В большинстве случаев приходится применять процедуру
подгонки, но иногда можно прямо использовать формулы. Для оценки
