Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Для измерения скоростей вращения в микро- и миллисекундном диапазонах
методом оптической спектроскопии нужно, чтобы время жизни возбужденного
состояния зонда было достаточно велико. Таким требованиям удовлетворяют
триплетные состояния некоторых люминесцирующих органических молекул. Это
могут быть как экзогенные зонды (например, производные эозина),
ковалентно "пришитые" к белку, так и эндогенные лиганды (например,
ретиналь в родопсине, бактериородопсине). В обоих случаях сначала после
импульсного освещения линейно поляризованным светом получают популяцию
ориентированных возбужденных молекул зонда. Такая ориентированная
популяция обладает анизотропией:
1) поглощения в основном состоянии;
2) поглощения в триплетном состоянии;
3) испускания света из триплетного состояния (фосфоресценции) ;
4) испускания света из короткоживущего синглетного состояния
(флуоресценции).
Вращение белковой молекулы с ковалентно пришитым к ней зондом приводит к
уменьшению анизотропии как поглощаемого, так и испускаемого света.
Поэтому, измеряя кинетику спада анизотропии, можно оценить скорость
вращения.
И теоретически, и практически для измерения спада анизотропии можно
использовать все четыре эффекта. Из применяющихся при этом физических
методов наименьшей чувствительностью обладают методы, основанные на
регистрации изменений поглощения [68]. Минимальная необходимая
концентрация зонда равна приблизительно 1 мкМ [68]. Чувствительность
методов, основанных на измерении фосфоресценции, примерно в 100 раз выше
[71]. Но гораздо большей чувствительностью обладает недавно описанный
метод "fluorescence depletion", основанный на эффекте (4). Сообщается,
что он в 106 раз чувствительнее метода фосфоресценции, и с его помощью
можно исследовать вращение мембранных белков на поверхности единичной
клетки [71, 73]. Используя этот метод, удалось измерить кинетику
Биофизические подходы
367
спада анизотропии при содержании менее 27 ООО молекул анионного
переносчика (полоса 3) на участке мембраны единичного эритроцита.
Полученные результаты хорошо согласуются с данными других авторов [73].
Как и в случае вращения сегментов липидных молекул (разд. 3.4), при
изучении вращательной диффузии мембранных белков основная сложность, по-
видимому, состоит в интерпретации кинетических кривых деполяризации. Спад
анизотропии сферической молекулы в изотропной среде описывается
одноэкспоненциальной кривой; для корректного описания вращения эллипсоида
нужны три экспоненты, а молекул неправильной формы - пять. Для описания
кинетики деполяризации флуоресценции в анизотропной среде (например, в
липидном бислое) или при наличии различных олигомерных форм белка
приходится использовать еще более сложные уравнения. На практике попытки
разложения полученной кинетической кривой более чем на две экспоненты
обычно выходят за пределы точности эксперимента. Поэтому в большинстве
случаев спад анизотропии описывают эмпирическими уравнениями, содержащими
две экспоненты и некую константу [68, 69, 72]. Определяемые таким образом
"времена вращательной корреляции" или аналогичные параметры характеризуют
вращательные свойства белка лишь очень приближенно (см., например, работу
[74]). Несмотря на это, спектроскопия триплетных состояний была и
остается одним из основных методов качественного и полуколичественного
анализа вращения белков в биомембранах.
4.1.2. ЭПР с переносом насыщения
При обычном ЭПР мощность микроволнового излучения стараются поддерживать
на уровне значительно более низком, чем уровень мощности, при котором
достигается насыщение наблюдаемого перехода. Метод ЭПР с переносом
насыщения основан на противоположном принципе. В каждый момент времени
при регистрации спектра ЭПР с насыщающим микроволновым излучением
взаимодействуют только те молекулы, которые ориентированы определенным
образом относительно направления приложенного магнитного поля. В
результате вращательной диффузии ориентация этих спиновых меток меняется
и они выходят из резонансного состояния, при этом другие молекулы
переходят в него [66, 68, 75]. Таким образом, вращательная диффузия будет
сильно влиять на форму спектра ЭПР. Этот эффект можно усилить, подобрав
специальные условия модуляции и методы детектирования сигнала [66, 75].
На рис. 8.10 продемонстрированы возможности применения метода ЭПР с
переносом насыщения для определения скоростей
368
Глава 8
молекулярного вращения. Исследовали свойства гемоглобина, содержащего
жестко закрепленную спиновую метку, в растворителях с разной вязкостью, а
значит, с разными временами вращательной корреляции (тк) белка. Амплитуды
сигналов с различными g-факторами довольно резко, а иногда монотонно
изменяются с изменением вязкости. В этом простом случае величину Тк можно
точно вычислить с помощью уравнения Дебая, а в качестве калибровочной
кривой использовать зависимость параметров спектра от времени корреляции
для изотропного вращения спиновой метки [76]. Однако в случае
