Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
необходимо иметь несколько производных данного липида, содержащих метки в
разных участках цепи.
3.3. Разделение фаз и доменная структура
При фазовых переходах в смесях липидов в системе одновременно могут
сосуществовать области с разной структурной организацией. Для обнаружения
латерального фазового разделения и образующихся доменов можно
использовать различные методы.
3.3.1. Дифракция рентгеновских лучей и нейтронов
Методы рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов используют не только для
изучения организации липидов в одной фазе (разд. 3.2.1), но и для
выявления неоднородности распределения липидов и латерального разделения
фаз. Как и в других случаях, более информативным оказывается метод
рассеяния нейтронов на дейтерированных липидах. Подробности применения
этих методов для изучения смеси фосфатидилхолин - холе-стерол можно найти
в работе [55].
24-1488
362
Глава 8
3.3.2. ЭПР спин-меченных пипидов
Форма линий спектра ЭПР нитроксильных радикалов (наиболее часто
используемая спиновая метка) определяется прежде всего спин-спиновым
обменным взаимодействием, которое при высоких концентрациях этих
радикалов может служить мерой взаимодействия между мечеными молекулами.
Если концентрацию меток в "жидком" бислое подобрать так, чтобы при их
равномерном распределении спин-спиновое взаимодействие было пренебрежимо
мало, то любое сильное уширение линий будет свидетельствовать о фазовом
разделении липидов и о концентрировании спин-меченных молекул в
образовавшихся доменах. Рис. 8.9 иллюстрирует применение метода спиновых
меток на
Рис. 8.9. Спектры ЭПР водных суспензий сппн-меченного дипальмитоил-
2 фосфатидилхолина в отсутствие немеченого липида (4) и в присутствии
немеченых дипальмитоилфосфатид-ной кислоты (3), дипальмитоилфосфа-
3 тидилэтаноламииа (2) и дипальмито-илфосфатидилхолииа (1) при моляр-
4 иом отношении 2:8; pH=9, Т=Ъ9°С. Форма спектров 4 и 3 обусловлена
уширеиием линий за счет спин-сппно-вого взаимодействия. (Из работы [56]
с разрешения авторов).
примере модельных мембран с высоким содержанием спин-меченных липидов.
Используя такой подход, можно также оценить размеры доменов [56]. Однако
распространить этот метод на биологические мембраны практически
невозможно, поскольку при необходимых для измерений высоких концентрациях
меток почти неизбежно происходит нарушение структуры мембраны.
3.3.3. Флуоресцентная спектроскопия
Об образовании в бислое "твердых" и "жидких" доменов можно судить по
изменению квантового выхода флуоресценции некоторых красителей, например
транс-паринаровой кислоты. Это вещество локализуется преимущественно в
квазикристал-лических "твердых" фазах фосфолипидов, и при этом
наблюдается существенное увеличение интенсивности его флуоресценции
Биофизические подходы
363
[57]. Другие вещества, например пирендеканоевая кислота, накапливается в
"жидкой" фазе; увеличение выхода флуоресценции в этом случае обусловлено
образованием эксимеров [56]. Таким образом, в обоих системах образование
соответствующих доменов при разделении фаз приводит к увеличению
интенсивности флуоресценции.
С помощью флуоресцентной микроскопии можно следить за образованием
флуоресцирующих и нефлуоресцирующих доменов в содержащих флуоресцентные
красители липидных монослоях на границе воздух - вода; появление подобных
доменов обусловлено латеральным разделением фаз при изменении температуры
или давления [58].
3.3.4. Электронная микроскопия
С помощью электронной микроскопии образцов, полученных методом
замораживания - скалывания, после напыления атомов тяжелых металлов можно
исследовать морфологию внутренних поверхностей двух монослоев [59]. Одно
из применений этой методики касается изучения модельных систем,
содержащих фазу Ра" которая на микрофотографиях выглядит как регулярная
"рябь" на поверхности мембраны [36]. В смешанных системах, содержащих эту
фазу, гладкие и шероховатые участки, а также участки с другими
морфологическими особенностями, могут существовать вместе [60].
Электронная микроскопия образцов, приготовленных методом замораживания -
скалывания, позволяет определить, какие именно факторы влияют на
распределение фаз в мембране. С помощью этой методики можно также
обнаружить в модельных липидных системах или биомембранах домены с
высоким содержанием стеролов. Для этого такие домены цитохимически
окрашивают филипином или сапонином. Специфически связываясь с Зр-
гидроксистеролами, эти вещества приводят к существенной деформации
поверхности скола [61]. Аналогично домен с высоким содержанием
отрицательно заряженных (кислых) липидов можно обнаружить, обработав
мембрану полимиксином [61].
Латеральное разделение фаз в биомембранах может сопровождаться
диссоциацией и, возможно, последующей агрегацией интегральных мембранных
белков. На электронных микрофотографиях сколов мембран при этом
наблюдаются четко выраженные скопления внутримембранных частиц.
3.4. Подвижность углеводородных "хвостов" липидных молекул
