Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
электронной микроскопии образцы в данном случае не нужно окрашивать,
чтобы не маскировать внутренние структуры. В некоторых случаях, однако,
важные структурные особенности, например трансмембранные каналы, можно
выявить при параллельном исследовании окрашенных образцов [25].
Предельная разрешающая способность этого метода в настоящее время
составляет, по-видимому, около 6 А (т. е. заметно ниже, чем для
рентгеновской кристаллографии трехмерных кристаллов).
Замечательный пример использования этого метода - пионерская работа
Хендерсона и Ануина по изучению бактериоро-допсина [27]. Этот
ретинальсодержащий белок (мол. масса 26 000) играет роль светозависимого
протонного насоса в пурпурной мембране бактерии Halobacterium halobium и
образует довольно обширные кристаллические бляшки, состоящие примерно из
10 000 гексагонально упакованных молекул. Авторы получили 15 картин
электронной дифракции и 18 электронных микрофотографий пурпурной мембраны
при различных наклонах образца, по которым была восстановлена трехмерная
контурная карта электронной плотности. Достигнутое разрешение составило 7
А в плоскости мембраны и 14 А в трансмембранном направлении. Из
полученных данных следовало, что белок состоит из семи палочковидных
полипептидных сегментов, по-видимому, а-спиральных участков, пересекающих
мембрану (рис. 8.4). Следует отметить, что с помощью такого подхода пока
не удалось выяснить структуру участков, соединяющих а-спирали,
последовательность соединения а-спиралей, расположение боковых групп
аминокислотных остатков и положение ретиналя.
2.4.3. Другие методы
Конформацию мембранных белков можно также изучать с помощью кругового
дихроизма (КД) и дисперсии оптического вращения (ДОВ), а также двух
других оптических методов - инфракрасной спектроскопии и спектроскопии
комбинационного
Биофизические подходы
351
Рис. 8.4. Построенная на основе -электронно-микроскопических данных
трехмерная модель структуры бактернородопсина. Изображены сечения,
параллельные плоскости мембраны. Верх и низ модели соответствуют участкам
молекулы, контактирующим с водной фазой; остальная часть белка заключена
в липидную фазу. Видно семь а-спиральных "палочек", на долю которых
приходится примерно 75% длины всего полипептида. Три из них (на заднем
плане) почти перпендикулярны плоскости мембраны, а другие немного
наклонены. Общие размеры белка 25x35x45 4. (Из работы [27] с разрешения
авторов.)
352
Глава 8
рассеяния. Вообще говоря, эти методы дают общую, а не детальную
структурную информацию. В то же время они имеют ряд преимуществ: не
требуют кристаллизации белка и могут применяться для исследования
мембранных суспензий и белков в растворе. Кроме того, спектральные
измерения относительно быстры и просты. С помощью этих методов можно 1)
определять содержание различных элементов вторичной структуры - а-
спиралей, p-слоев и неупорядоченных участков; 2) изучать конформационные
переходы.
1. Круговой дихроизм. Под круговым дихроизмом (КД) понимают явление,
состоящее в разном поглощении света с правой и левой круговой
поляризацией [28]. Метод ДОВ основан на различии соответствующих
коэффициентов преломления. Оба метода очень чувствительны к изменениям
вторичной структуры белков. В большинстве случаев лучше использовать КД,
чем ДОБ. Подробно применение этих методов к исследованию мембран описано
в книге [29].
Для определения содержания структур различных типов (а-спиралей, p-слоев
и неупорядоченных участков) измеряют спектр КД в диапазоне 185-240 нм.
Затем методом наименьших квадратов подбирают такую линейную комбинацию
трех базисных функций, описывающих спектры КД различных типов вторичных
структур, которая лучше всего соответствовала бы экспериментально
наблюдаемому спектру. Такая процедура прямо дает долю стуктур разного
типа в исследуемом полипептиде. Интерпретация данных довольно однозначна,
однако при исследовании белков, встроенных в бислой и/или образующих
агрегаты [29], возникает целый ряд проблем. Так, по одним данным [29] в
бактериородопсине содержится семь а-спиральных "палочек", а по другим
[30] - только пять, а остальная часть молекулы находится в виде р-слоев
[30]. Как нам кажется, подобные оценки содержания различных структурных
элементов в мембранных белках имеет смысл рассматривать лишь как
полуколичественные.
Несколько слов об исследовании конформационных изменений с помощью КД.
Ясно, что структурные изменения белков сопровождаются спектральными
изменениями. При интерпретации этих изменений и попытках связать их с
перестройками вторичной структуры возникают те же трудности, что и при
оценке содержания а-спиралей и р-слоев.
2. Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния.
Эти методы основаны на измерении колебательных спектров белков. Основные
измеряемые параметры - это положение и интенсивность так называемых полос
амид I и амид III (см. обзоры [31, 32]). С помощью этих методов можно
