Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
ориентированного мембранного мультислоя СР, образованного двумя
противоположным образом направленными профилями слоев, принадлежащих двум
уплощенным однослойным везикулам СР; профиль единичной мембраны заключен
в интервале 0А<|Х|<80А. Б. Профиль электронной плотности асимметричного
липидного бислоя. В. Профиль отдельной белковой глобулы, представленный в
виде площади в плоскости мембраны, занятой белком. Расположение белка в
бислое можно также представить в виде профиля диаметра белковой глобулы
(Г). Для мембран СР получаемая картина соответствует структуре,
цилиндрически усредненной относительно нормали к плоскости мембраны. (Из
работы [16( с
разрешения авторов.)
348
Глава 8
длин осей [9, 19], а сравнивая экспериментально определенную величину F с
теоретической, можно оценить относительные размеры "эквивалентного"
эллипсоида, а значит, и общую форму частицы. Коэффициент трения в свою
очередь определяют либо из коэффициента диффузии (его измеряют с помощью
аналитического ультрацентрифугирования или лучше неупругого
светорассеяния), либо из коэффициента седиментации частиц (измеряемого
аналитическим ультрацентрифугированием) [9,19]. Зная вязкость, можно
оценить параметр, близкий к F (коэффициент Симхи v) [9, 19]. Техника
эксперимента относительно проста, поэтому определение F или и вполне
оправданно, особенно если больше ничего неизвестно о форме частицы. В
случае интегральных мембранных белков, однако, возникают серьезные
проблемы, связанные с учетом вклада связанного с белком детергента; этот
вклад может оказаться весьма значительным.
2.4. Конформация полипептидной цепи
2.4.1. Рентгеновская днфракция на трехмерных кристаллах
Рентгеноструктурный анализ единичных кристаллов белков - это классический
метод определения их трехмерной структуры. Целью такого анализа является
построение трехмерной карты электронной плотности. Количество получаемой
при этом информации определяется разрешением карты, которое в свою
очередь зависит от качества кристаллов белка и объема собранных и
используемых данных. При разрешении 6-7 А можно определить детальную
форму белковой глобулы, субъединич-ную организацию, наличие спиральных
участков; можно различить также некоторые характерные структурные
особенности, например щели и полости. При разрешении 4 А удается выявить
элементы вторичной структуры, природу, длину и направление связей. Карты
электронной плотности с разрешением лучше 2 А позволяют определить
положение индивидуальных аминокислотных остатков полипептидной цепи.
Детальное описание этих методов можно найти в книгах [9, 20].
Исследование с помощью рентгеноструктурного анализа интегральных
мембранных белков долгое время было невозможно, поскольку не удавалось
получить хорошие трехмерные кристаллы таких белков (см. работу [21] и гл.
5). Лишь недавно были выращены кристаллы порина из Escherichia coli [22]
и фотосинтетического реакционного центра одного из видов пурпурных
бактерий [21], причем в последнем случае была установлена полная
трехмерная структура с разрешением ЗА [23].
Определение детальной структуры мембранных белков ме-
Биофизические подходы
349
тодом рентгеновской дифракции - крайне трудоемкая процедура, поэтому н
число белков, которые удается исследовать этим методом, вероятно, будет
очень небольшим. В то же время рентгеноструктурный анализ - это
единственный метод, позволяющий получить детальную информацию о
структурных особенностях мембранных белков и их структурно-функциональных
связях.
Недавние успехи в области нейтронной кристаллографии позволяют в
дополнение к рентгеноструктурному анализу с высоким разрешением проводить
измерения дифракции нейтронов на кристаллах мембранных белков. Методы
нейтронной и рентгеновской дифракции очень сходны как по
экспериментальной методологии, так и по получаемой структурной
информации. Однако карты нейтронной плотности в отличие от карт
электронной плотности содержат информацию о положении атомов водорода
(или дейтерия). Поэтому эти два метода могут дополнять друг друга [24].
Рис. 8.3. Электронные микрофотографин оттененных образцов спектрина и
спектрина/анкерина из мембран эритроцитов человека. А. Димеры спектрина.
Ь. Тетрамеры спектрина. В. Ассоциаты димеров спектрина с анкерином. Г.
Ас-соцнаты тетрамеров спектрина с анкерином. Стрелками показано положение
анкерина. (Из работы [18] с разрешения авторов.)
350
Глава 8
2.4.2. Электронно-микроскопический анализ двумерных кристаллов
Некоторые мембранные белки в нативных условиях формируют двумерную
кристаллическую решетку. В ряде случаев образование такой решетки можно
индуцировать либо в самой мембране, либо после встраивания белка в
липидный бислой. Электронная микроскопия такого двумерного кристалла при
разных углах наклона плоскости кристалла в сочетании с анализом дифракции
электронов позволяет определять трехмерную молекулярную структуру белка
(описание метода см. в работах [20, 25, 26]). В отличие от обычной
