Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
методы. Наиболее популярные из них - малоугловое рассеяние (особенно
рассеяние нейтронов) и обычная электронная микроскопия.
2.3.1. Малоугловое рассеяние
Данные по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей или нейтронов
гомогенными макромолекулами или их комплексами позволяют оценить не
только их молекулярную массу (разд. 2.2.3), но и весьма ценный параметр,
характеризующий ¦общий размер, а именно - радиус инерции R. Радиус
инерции/? в данном случае - это среднеквадратичное расстояние между
центрами рассеяния и центром тяжести молекулы с учетом плотности
рассеяния. Определяемое таким образом значение R увеличивается с
увеличением анизотропии частиц и объема полости внутри частицы, а
следовательно, может служить мерой их компактности. Если известна,
скажем, общая форма частиц, то зная R, можно оценить их размер [13].
Дополнительную информацию о форме частиц дает анализ кривой рассеяния в
широком интервале углов. К сожалению, готового соотношения, связывающего
форму кривой и форму частицы в общем или в каком-либо конкретном случае,
не существует. Поэтому обычно сравнивают полученную экспериментальную
кривую рассеяния с теоретическими кривыми, рассчитанными сначала для
простых тел (со случайной ориентацией). По достижении некоторого
соответствия уточняют модель, рас--смотрев более сложные варианты.
Поскольку близкие кривые рассеяния можно получить для совершенно разных
моделей, выбор наиболее подходящей модели требует дополнительных данных,
например электронно-микроскопических. Несмотря на все эти сложности, во
многих случаях такой подход оказался весьма успешным [13].
Вообще говоря, на кривые рассеяния влияет связанный с белком детергент
(разд. 2.2.3). В случае нейтронного рассеяния это влияние можно
устранить, используя подходящие смеси H20/D20. В отсутствие детергентов
возможности обоих методов-малоуглового рентгеновского рассеяния и
рассеяния нейтронов - довольно близки.
Методы малоуглового рассеяния молено применять также для исследования
интактных и реконструированных мембранных систем, предпочтительно
находящихся в виде "стопок" [И, 15]. При этом получают цилиндрически
усредненное относительно нормали к плоскости мембраны (а таюке
усредненное по времени) распределение молекул белков и липидов. Однако
чаще подобные системы исследуют методом рассеяния нейтронов,
346
Глава 8
особенно в сочетании с изоморфным замещением (например, дейтерированием)
определенных мембранных компонентов. Максимальное пространственное
разрешение составляет примерно 10 А, а положение определенных меченых
атомов в цилиндрически усредненной симметричной структуре можно
определить с точностью I А. Рис. 8.2 иллюстрирует применение методов
рассеяния для исследования мембран саркоплазматиче-ского ретикулума. С
помощью интенсивного синхротронного излучения или рентгеновских
источников на лазерной плазме можно проследить за изменением структуры
мембран во времени [15]. По-видимому, в будущем такой подход позволит
значительно глубже проникнуть в природу структурно-функциональных связей
в биологических мембранах.
2.3.2. Электронная микроскопия
Разрешающая способность электронного микроскопа лежит в диапазоне 20-40
А, что соответствует средним линейным размерам белков с мол. массой около
20000. Таким образом, этот метод позволяет грубо оценить размеры и форму
большинства мембранных белков. К сожалению, в ходе приготовления
препаратов форма белковых частиц может существенно измениться. Это
относится как к негативному контрастированию, так и к напылению -
стандартным способам окрашивания частиц [17]. И тем не менее электронная
микроскопия - это основной метод, позволяющий судить о форме и размерах
солюбилизированных мембранных белков, особенно если частицы имеют
продолговатую форму. В качестве убедительного примера можно привести
изучение спектрина - основного компонента цитоскелета мембран эритроцитов
- и его взаимодействия с анкерином [18]. Методом оттенения изолированных
белковых частиц, напыляя металл под малым углом на вращающийся образец,
удалось оценить размеры белка, установить конфигурацию спектриново-го
гетеродимера и проиллюстрировать его гибкость, а также определить
упаковку димеров в тетрамере спектрина и локализацию центров связывания
анкерина (рис. 8.3).
2.3.3. Гидродинамические методы
Зная коэффициент трения частицы солюбилизированного белка и его
молекулярную массу, можно определить так называемый формфактор, или число
Перрена F, для белковой гло-лубы; это число равно отношению коэффициента
трения частицы к коэффициенту трения сферы равного объема. Значение F
несложно вычислить для эллипсоидов с разным отношением
I
°s
1
I-
g
Рис. 8.2. Профиль электронной плотности мембраны саркоплазматического ре-
тикулума (СР) с разрешением 10 А, полученный путем совместного
использования методов рентгеновской и нейтронной дифракции. А. Профиль
электронной плотности (абсолютная шкала) единичного элемента
