Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
растворами макромолекул или их комплексов. Значение молекулярной массы
вычисляют, зная интенсивность рассеяния в центральном максимуме, кривую
рассеяния на очень малые углы и экстраполируя эти данные к нулевому углу.
Аналогичную информацию можно получить из экспериментов по рассеянию света
(на любые углы). Во всех этих случаях необходимо знать удельный объем
белковой глобулы. Как и для аналитического ультрацентрифугирования, при
определении молекулярной массы по рассеянию в растворах возникают
проблемы, связанные с вкладом ассоциированных с белком молекул
детергента. При малоугловом рентгеновском рассеянии и светорассеянии этот
вклад учесть крайне трудно. В случае же рассеяния нейтронов вклад
детергентной "шубы" можно вычленить, используя смеси H2O/D2O, плотность
которых сравнима с плотностью детергента.
Детальное описание методов, основанных на рассеянии в растворах, можно
найти в книге [9]. По сравнению с аналити-
Биофизические подходы
343
ческим ультрацентрифугированием они имеют два недостатка:
1) концентрация белка должна быть примерно в 100 раз больше; 2)
практически невозможно оценить степень гомогенности материала. Впрочем,
проводя измерения при разных концентрациях растворенного вещества,
удается выявить наличие равновесных ассоциатов. Вообще говоря, основная
цель экспериментов по малоугловому рассеянию состоит в изучении формы
молекул (см. ниже).
Регистрируя изменение светорассеяния в суспензиях мембранных везикул,
можно следить за реакциями ассоциации и диссоциации белков на поверхности
мембраны [10].
2.2.4. Центрифугирование в градиенте сахарозы и гель-фильтрация
Вес частиц, состоящих из солюбилизированных детергентом мембранных
белков, можно также оценить, подставив в преобразованное уравнение
Сведберга значение коэффициента седиментации, измеренного методом
зонального центрифугирова-
Рис. 8.1. Анализ седиментациониого равновесия солюбилизированного в
тритоне Х-100 анионного переносчика (полоса 3) из мембран эритроцитов
человека. Плотность растворителя была подобрана так, чтобы она была равна
плотности детергента. А. Экспериментальная зависимость концентрации белка
от радиуса (крестики) и теоретическая кривая (-), построенная по
экспериментальным точкам методом наименьших квадратов с использованием
модели самоассоциации моиомер/димер/тетрамер. Б. Относительное содержание
различных олигомерных форм в зависимости от локальной концентрации белка.
Дополнительные данные указывают на существование в системе равновесия
мономеры - олигомеры. (Из работы [8] с разрешения авторов.)
23*
:344
Глава 8
ния в градиенте плотности сахарозы (относительно стандартных
водорастворимых белков), н значение кажущегося радиуса Стокса,
измеренного с помощью гель-фильтрацин [1]. Этот метод довольно прост и не
требует наличия сложной аппаратуры ¦или высокоочнщенного материала.
Необходимо, однако, отметить два существенных момента: во-первых,
отсутствует теоретическое обоснование метода; во-вторых, на определяемые
коэффициенты седиментации и радиусы Стокса неконтролируемым образом
влияет связанный с белком детергент, а также .гидратация белка |1].
Поэтому мы не рекомендуем применять этот метод к интегральным мембранным
белкам.
2.2.5. Радиационная инактивация (см. также гл. 6)
Под действием ионизирующей радиации функциональная .-активность ферментов
и рецепторов уменьшается. Теория мн-.шени связывает зависимость потери
активности от дозы с размерами мишеней, а следовательно, н с их
молекулярной массой. Поскольку измеряемой величиной является
биологическая активность, такой метод должен в принципе давать
молекулярную массу некоей функциональной единицы, а не физического
комплекса [11]-
Согласно теории мишени, повреждение функциональных •единиц целиком
обусловлено первичной ионизацией. Поскольку ш водных растворах возможны
вторичные эффекты, опыты по радиационной инактивации обычно проводят на
сухих, а еще лучше - на замороженных образцах. При этом нет необходимости
очищать белок, поэтому исследовать можно и мембрано-•связанные ферменты,
и рецепторы в их естественном окружении.
Такой подход весьма информативен, но его применение со-щряжено с рядом
серьезных проблем, например с переносом энергии (Г11- 12]; см. также гл.
6). Его лучше всего использовать в сочетании с другими методами.
2.3. Размеры молекул
Для получения детальных и достоверных данных о форме "белков н их
комплексов применяют два метода: дифракцию рентгеновских лучей на
трехмерных кристаллах и реконструкцию трехмерного изображения по серии
электронных микрофотографий двумерных кристаллов белка при разных углах
наклона образца (см. разд. 2.4). В зависимости от разрешения с помощью
этих методов можно получить подробную картину укладки полнпептидной
спирали в пространстве. Однако для большинства мембранных белков пока не
удается получить со-
Биофизические подходы
345
вершенных кристаллов, поэтому приходится применять менее чувствительные
