Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
проводят гидролиз белка в мембране или в солюбилизированном детергентом
состоянии. При этом расщеплению подвергается только очень небольшое число
пептидных связей. Лучше всего, чтобы белок оставался в нативном
состоянии, причем оптимальным окружением для него является липидный
бислой. Выбор протеазы определяется прежде всего природой исследуемого
белка. Хорошие результаты были получены с протеазой из Staphylococcus
aureus V8, которая расщепляет белок по остаткам глутаминовой кислоты,
находящимся на его С-концевом участке [22], в следующих условиях:
а) 50-100 мМ фосфатный буфер pH 7,0;
б) 1 мг/мл мембранного белка (в мембране или в детергенте) ;
в) протеаза V8 в концентрации до 2% (в/в);
г) 25-37°С, время инкубации до 6 ч.
Эти условия можно несколько изменить, чтобы добиться эффективного
расщепления только по нескольким точкам. Фермент можно использовать даже
при концентрациях ДСН порядка 0,1-1,0%. Среди других протеаз следует
упомянуть также трипсин, химотрипсин, термолизин и эндопротеазы Lys-C и
Arg-C, инкубацию с которыми можно проводить в фосфатном или бикарбонатном
буфере при pH 7,0-8,0. Образующиеся при этом крупные фрагменты можно
разделить хроматографированием в органических растворителях или
электрофорезом в ПААГ с ДСН. Если используется последний метод, ча-
18*
276
Глава 6
сто бывает полезно провести предварительный электрофорез в течение
нескольких часов, чтобы удалить агенты, которые могут блокировать N-
конец, но это нередко приводит к уши-рению белковых полос. Добавление
тиогликолевой кислоты (до 1%) в рабочий буфер помогает защитить остатки
метионина. Более глубокое расщепление осуществляют такие ферменты, как
проназа, субтилизин и папаин. Расщепление этими ферментами в сочетании с
электрофорезом в полиакриламидном геле можно с успехом использовать для
получения пептидных карт [70, 71].
Второй этап фрагментации включает дальнейшее расщепление очищенных
крупных полипептидных фрагментов с целью получения смесей пептидов, более
простых, чем при расщеплении самого белка. На этой стадии протеолиз часто
не доходит до конца из-за плохой растворимости фрагментов или их
склонности к агрегации, а также из-за денатурирующего действия
растворителя. Более эффективным может оказаться химическое расщепление,
особенно по остаткам метионина с помощью бромциана (CNBr). Ниже описана
простая методика проведения такого расщепления.
1. Растворяют белок/пептид в 70%-ной муравьиной кислоте или ТФУ
(последняя более предпочтительна при расщеплении связей Met-Thr и Met-
Ser, но, с другой стороны, она способствует окислению остатков триптофана
[4]).
2. Добавляют 50-100-кратный избыток (по числу молей) CNBr по отношению к
метионину (имейте в виду, что CNBr разлагается с образованием очень
токсичных цианидов, поэтому все операции с ним, включая взвешивание и
проведение реакций, необходимо осуществлять в вытяжном шкафу).
3. Проводят инкубацию в атмосфере N2 в темноте при 20- 25 °С при
осторожном перемешивании в течение 24 ч.
4. Упаривают на роторном испарителе почти досуха.
5. Добавляют воду и лиофилизуют.
Может оказаться полезным и химическое расщепление по остаткам триптофана
с помощью о-иодозобензойной кислоты в присутствии тирозина [72] или BNPS-
скатола [73], по связям аспарагин - глицин с помощью гидроксиламина [74]
и в меньшей степени по остаткам цистеина с помощью 2-нитро-5-тио-
цианобензойной кислоты [75]. Образовавшиеся при этом пептиды можно
очистить в органических и/или кислотных растворителях с помощью гель-
фильтрации, хроматографии с обращенной фазой (см. выше), а иногда с
помощью аффинных сорбентов,. способных взаимодействовать с SH-группами.
Выделение и модификация мембранных белков
277
5.2. Определение концентрации белка
Присутствие детергентов и фосфолипидов в сочетании с малыми количествами
белка может значительно затруднить определение его концентрации. В табл.
6.3 перечислены те методы, которые можно использовать для этой цели. К
сожалению, ни один из них нельзя признать совершенным и рекомендовать для
повсеместного применения; и все же мы считаем, что наиболее надежными
являются методы с использованием флуорес-камина (фирменное название
Fluram, фирма Roche) [76] и нингидрина (в ручном варианте) [77], и
особенно те подходы, которые основаны на результатах аминокислотного
анализа. В последнем случае необходимо иметь соответствующее оборудование
(что становится все более проблематичным) и квалифицированных
специалистов. Однако ручной нингидриновый метод, хотя и требующий
значительных затрат труда и времени, если анализируется большое число
образцов, тем не менее является довольно чувствительным, надежным и
применим к трудным в работе белкам и пептидам, т. е. таким, которые
удается растворить только в смесях органических растворителей. Очень
полезны также методы Бредфорд [78], ВСА (фирма Pierce) и микро-Лоури
[79]; они несложны и обладают такой же чувствительностью, как и метод с
