Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
мешочек можно закрепить за нижний край трубки (см. рис. 6.1).
аминокислотной последовательности), рекомендуется использовать кумасси
синий R, ацетат натрия или КС1 [59-61], а также обратимо связывающиеся
флуоресцентные метки [62]. Такие реагенты, как дансилхлорид,
флуорескамин, о-фталевый альдегид, или реагенты, применяющиеся в методике
окрашивания геля солями серебра или при обнаружении гликопротеинов,
использовать не рекомендуется - все они необратимо модифицируют белок по
аминогруппам. Наиболее предпочтительны те процедуры, при которых белок
можно идентифицировать с помощью специальных лигандов (радиоактивных,
флуоресцентных и т. п.), которые были заранее ковалентно связаны с белком
путем модификации ограниченного числа остатков (например, Cys, Туг), а
также специфических антител, меченных 1251, или лектинов. Наиболее
эффективная методика извлечения белка из геля - электроэлюция с диализом
- описана в табл. 6.2. Весьма полезным может оказаться и обычный диализ.
Оба метода пригодны и в случае высушенных, а затем регидратированных
гелей, но выход белка при этом будет ниже. Судя по нашему опыту,
методики, предусматривающие разрушение или растворение геля, дают
препараты неудовлетворительного качества либо из-за внесения загрязнений,
либо за счет необратимой модификации или деградации белка.
После извлечения белка может понадобиться удалить ДСН. Для этого
используют либо специальные сорбенты для связывания детергента [64-67],
либо его осаждение [60, 68], либо простой диализ в течение длительного
времени (5 сут) с несколькими сменами буфера. В большинстве случаев
некоторое количество ДСН оставляют (хотя бы для того, чтобы белок
продолжал находиться в растворе). Для вытеснения остаточного количества
ДСН обычно добавляют в большом избытке другие детергенты, а в некоторых
случаях и денатурирующие агенты - 2-8 М мочевину или 2-6 М
гуанидингидрохлорид. Самый эффективный способ удаления следов детергента
включает использование органического растворителя (например, смеси FACE)
с последующей гель-фильтрацией на сефадексе LH-60 или LH-20 (разд.
3.2.2).
5. Анализ мембранных белков
После очистки белка можно применить все обычные аналитические методы
изучения его структуры - установить аминокислотный состав, определить N-
и С-концевые остатки, содер-
18-1488
274
Глава 6
Рис. 6.1. Аппарат для электрофоретической экстракции белков из
полиакриламидных гелей [63]. Он состоит из верхнего резервуара А,
положение которого можно менять по высоте, и нижнего резервуара Б. В оба
резервуара помещено по кусочку платиновой проволочки, подсоединенной к
электрическому разъему для подведения напряжения. Циркуляция буфера между
резервуарами осуществляется с помощью перистальтического насоса; трубка
для перекачки буфера обозначена на рисунке буквой В. Можно проводить
экстракцию до 18 образцов геля одновременно (два ряда по девять
отверстий). Здесь показаны три образца; они помещены в пипетки емкостью
10 мл, срезанные на высоте, отвечающей 5 мл. Остальные отверстия закрыты
пластиковыми центрифужными пробирками. Верхняя часть пипетки
(предварительно промытой кислотой) герметично закрыта кусочками
целлофановой диализной пленки, прижатой резиновым колечком. Белки
подвергают электроэлюцни (при напряжении 50 В в течение 12-18 ч) в
отрезке диализной трубки Г, закрепленном с помощью резинового колечка на
кончике пинетки и герметизированном снизу с помощью зажима Mediclip
(Spectrum Medical Industries Inc., 60916 Terminal Annex, Los Angeles, CA
90054). Примерно такую же систему можно собрать на основе прибора для
кругового электрофореза (Medina, Findlay, неопубликованные данные). Очень
полезно изготовить стеклянные трубки так, чтобы они имели небольшие
канавки в своей верхней и нижней частях, предназначенные для резиновых
колечек, что обеспечивает более надежную герметизацию соединений.
Выделение и модификация мембранных белков
275
жание углеводов, первичную структуру и т. д. Но прежде всего надо
позаботиться, чтобы белок находился в солюбилизированной,
неагрегированной форме. Это особенно важно, когда проводится его
ферментативное расщепление. Общие методы анализа белков детально описаны
в другой книге данной серии [69]. Но есть целый ряд важных моментов,
которые необходимо при этом иметь в виду.
5.1. Расщепление белка
Очистка пептидов, получаемых из интегральных мембранных белков, крайне
затруднена из-за их повышенной склонности к агрегации и плохой
растворимости в большинстве водных систем. В детергентах они находятся в
мицеллах преимущественно в виде смеси, а не как отдельные мономерные
формы и этим отличаются от интактного белка или его крупных фрагментов.
Возможности применения различных хроматографических методик с
использованием органических растворителей ограничиваются тем, что для
растворения пептидов часто необходимы крайние значения pH.
С учетом всего этого часто расщепляют полипептиды в два приема. Сначала
