Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
подвергнуть электрофоретическому разделению или сначала проинкубировать
при различных температурах (например, в течение 60-90 мин при 20-30 °С),
чтобы дезагрегировать белок до мономерного состояния. Образец можно также
прокипятить в течение 3 мин, главным образом для того, чтобы разрушить
протеазы. Однако при этом следует проявлять большую осторожность,
поскольку некоторые мембранные белки, например родопсин, а также р-
адренэрги-ческий, мускариновый и никотиновый рецепторы, агрегируют при
кипячении. Протеолиз при солюбилизации может представлять серьезную
проблему, поскольку денатурированные мембранные белки являются
прекрасными субстратами для протеаз, которые обычно устойчивы к ДСН и
могут даже активироваться в процессе растворения мембран. Учитывая это
обстоятельство, лучше сразу же готовить мембраны в буфере, содержащем
один или несколько протеазных ингибиторов (см. приложение I). Если же
необходимы дополнительные меры предосторожности, то имеет смысл вместе с
ДСН добавить еще ФМСФ (1 мМ) и ЭДТА (10 мМ). Перед электрофорезом образец
можно сконцентрировать лиофилизацией, ультрафильтрацией (в концентраторах
типа Amicon Centricon) или осаждением 50-90%-ным ацетоном (впрочем,
последнее не рекомендуется, поскольку это затрудняет ресолюбилизацию
белка до мономерного состояния).
4.1. Извлечение белка из геля
После электрофореза белки можно обнаружить в геле с помощью целого ряда
методов. Поскольку предполагается дальнейшее исследование белков
(например, определение их
272
Глава 6
Таблица 6.2. Электроэлюция белков из полиакриламидного геля после
электрофореза в присутствия ДСН
Оборудование/Реагенты
1. Плоскодонная камера, обычно используемая для разделения ДНК, или
модифицированный прибор для гель-этекгрофореза в трубках (см. рис. 6.1).
2. Трубки для диализа, прокипяченные в течение 15 мин в 0,1 М бикарбонате
натрия с 20 мМ ЭДТА, затем тщательно промытые дистиллированной водой. Для
небольших белков и пептидов рекомендуется использовать трубки типа
Spectropor.
3. Окраин ваклций раствор кумассн: 0,1%-ный раствор (в/о) красителя
кумас-си ярко-сннего в 50%-ном (о/о) водном метаноле, содержащем 7%-ную
(о/о) уксусную кислоту. Раствор для отмывания красителя имеет тот же
состав, но не содержит красителя.
Методика
1. Быстро (за 5-10 мин) окрашивают гель кумасси синим, затем выдерживают
в отмывающем растворе до тех пор, пока не проявятся полосы белка (10-15
мин). Время окрашивания и отмывания должно быть как можно меньше, чтобы
гарантировать максимальный выход белка при его последующей экстракции.
2. Вырезают полосы геля с пептидами, представляющими интерес. Гель не
разрушают и не гомогенизируют.
3. Наполняют камеру буфером, содержащим 25 мМ трис-глицин (pH 8,5) н
0,1%-ный ДСН; 50 мМ трис-ацетат (pH 7,8) и 0,1%-ный ДСН или 0,1 М фосфат
натрия (pH 7,8) и 0,10%-ный ДСН, до уровня примерно на 1 см выше
платформы. При необходимости к буферу можно добавить 2-меркап-тоэтанол
(0,1%, о/о) или днтиотреитол (2-5 мМ). Чтобы гарантировать полное
растворение белков, концентрацию ДСН можно повысить до 1% (в/о).
4. Отрезают кусок диализной трубки такой длины, чтобы в него вместился
образец гетя и осталось еще по 2 см с каждого края. Зажимают трубку с
одного конца с помощью зажима типа Mediclip и заполняют ее буфером пз
камеры. Помещают вырезанный образец геля в трубку и осторожно выдавливают
из нее большую часть жидкости, а затем закрывают сверху'. Следует принять
меры, чтобы исключить попадание в мешочек пузырьков воздуха.
5. Закрепляют диализный мешочек на платформе электрофоретической камеры.
Подгоняют уровень буфера так, чтобы он покрывал мешочек.
6. Проводят электрофорез в течение 3-20 ч при напряжении 25-100 В и силе
постоянного тока 20-150 мА, затем меняют направление тока примерно на 30
с, чтобы электрофоретически десорбировать белок с поверхности диализной
мембраны. Если окрашивание геля и отмывание красителя проводили в течение
длительного времени, то соответственно больше времени потребуется и на
электроэлюцию.
7. Вынимают образец геля пз мешочка. Прокрашивают его еще раз, чтобы
убедиться в полном вымывании белка. Все частички геля, которые могут
остаться, следует полностью удалить. При необходимости раствор можно
слить и быстро отцентрифугировать или отфильтровать для удаления всех
твердых примесей. Мешочек снова закрывают и диализуют раствор белка
против по меньшей мере пяти смен дистиллированной воды (каждая смена по 5
л) в речение 2-3 сут при 0-4 °С. В диализуюгций раствор можно добавить
ДСН до концентрации 0,25% (в/о), чтобы сохранить белок в растворенном
состоянии, но последний диализ следует проводить только против
дистиллированной воды. Краситель кумассн все время остается связанным с
белком, благодаря чему можно контролировать ход электроэлюцин.
Выделение и модификация мембранных белков
273
Модификации
Эту методику можно использовать при любом способе окрашивания геля и с
любым прибором для вертикального электрофореза в трубках, где диализный
