Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
обрабатывают затем нейраминидазой (разд. 6.1.2), чтобы экспонировать
новые концевые углеводные остатки, которые в свою очередь можно
использовать для связывания с аффинным носителем [53]. Наконец, по не
совсем понятным причинам небольшие углеводсодержащие пептиды часто не
связываются аффинными лектиновыми сорбентами, даже если исходные белки
дают хорошее связывание.
Альтернативный вариант основан на неспецифическом связывании
углеводсодержащих белков на двух боронатных сорбентах (табл. 6.1) с
последующим элюированием буфером, содержащим сорбитол, цитрат или ацетат
либо, за неимением лучшего, растворами с низкими pH (например, 25 мМ НС1,
100 мМ муравьиной кислотой). Этот подход сравнительно нов и пока мало
использовался для мембранных белков.
3.4.3. Практические рекомендации
Образцы следует наносить на колонку, содержащую аффинный сорбент
(например, 10-20 мл упакованного сорбента), при низкой скорости потока
(2-3 мл/ч), чтобы условия взаимодействия были максимально близки к
равновесным. При повышенных температурах (20-35 °С) связывание может
усилиться. В некоторых случаях бывает полезно сразу после нанесения
образца на какое-то время совсем приостановить проток буфера через
колонку. После этого носитель следует промыть 5- 10 объемами буфера,
равными объему колонки, чтобы удалить несвязавшиеся или слабо связавшиеся
компоненты. На этом .этапе можно повысить ионную силу буфера для
ослабления не-
270
Глава 6
специфического связывания. Элюирующий буфер пропускают через колонку до
тех пор, пока какой-либо параметр (например, оптическая плотность при 280
нм) не достигнет фонового уровня. Это показывает, что носитель уже
достаточно промыт. Элюирование специфически связавшихся компонентов
обычно происходит быстро; они выходят в виде асимметричного пика с крутым
передним фронтом и растянутым хвостовым участком. Попытки улучшить
разделение путем введения градиента сахара при элюировании с лектиновых
сорбентов не дали ощутимых результатов. Если образец наносят на колонку
при повышенной температуре (20-30 °С), то элюирование часто облегчается
при снижении температуры до 4 СС.
После промывания концентрированными солевыми растворами сорбент можно
хранить в течение 1-2 лет в растворе, содержащем ингибиторы протеаз,
антибактериальные агенты, а также субстраты или его аналоги. Перед
использованием сорбенты тщательно промывают буфером (до 100 собственных
объемов), в котором предполагается наносить образец. Иногда до
уравновешивания сорбента с буфером его промывают 0,01%-ным ДСН, но эта
операция приемлема лишь в том случае, если ковалентно связанный на
носителе белок устойчив по отношению к ДСН или легко ренатурнрует после
удаления последнего. Имейте в виду, что при смешивании ДСН с растворами,
содержащими ионы калия, или с детергентом типа додецилтрнметиламмо-
инйбромида происходит выпадение осадка.
4. Гель-электрофорез
Современные методы рекомбинантных ДНК и определения первичной структуры
белков в некоторых случаях избавили исследователей от необходимости
проводить очистку белка классическими методами. Если изучаемый белок
удается идентифицировать в условиях одномерного или двумерного
электрофореза, его можно элюировать с геля в условиях, при которых
возможно последующее определение аминокислотного состава и частичной
аминокислотной последовательности. В одной из книг этой серии [54]
детально описаны теория и практика гель-электрофореза. Для мембранных
белков предложены системы, содержащие неденатурирующие детергенты,
например тритон Х-100 [55] и дезоксихолат [56], однако при этом часто не
удается достичь высокого разрешения. Интересные перспективы в этом
отношении открывает метод электрофореза со сдвигом заряда (см. Приложение
V). Денатурирующие детергенты находят широкое применение в
электрофоретических исследованиях, особенно при проведении электрофореза
в полиакриламидном геле. Чаще всего используют додецилсульфаты натрия н
лития, обладающие высокой солюбилизирующей способностью
Выделение и модификация мембранных белков
271
[57]. Хлоральгидрат, в принципе тоже очень полезный агент
[58], использовать все же не стоит из-за его токсичности, особенно при
тех высоких концентрациях, которые здесь необходимы.
Как правило, количество ДСН, добавляемого к мембранному препарату, должно
по крайней мере в два раза превышать общий сухой вес препарата, так чтобы
концентрация ДСН сохранялась на уровне 1 % или выше. pH буфера можно
менять в широких пределах (обычно от 5 до 9). Часто к смеси добавляют
восстанавливающие реагенты. Наш опыт работы с мер-каптоэтанолом
показывает, что при используемых высоких концентрациях (1-5%) он может
индуцировать протеолиз. Поэтому предпочтение следует отдавать
дитиотреитолу, который можно брать в низких концентрациях (2 мМ).
Присутствие сахарозы и глицерола на стадии солюбилизации мембран также не
является обязательным, но их можно ввести в буфер, применяемый для
нанесения образца на гель. После солюбилизации образец можно сразу
