Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
растворов, содержащих детергенты. Правда, иногда наличие таких
удлинительных мостиков приводит к усилению неспецифичных взаимодействий.
Можно надеяться, что в будущем аффинные носители найдут еще более широкое
применение при фракционировании белков методами ВЭЖХ и СЖХБ.
3.4.2. Лиганды
Практически во всех случаях лиганд связывают с носителем через первичные
амино-, карбокси- и сульфгидрильные группы. Из табл. 6.1 видно, что все
небольшие лиганды и белки, имеющие подходящие функциональные группы,
можно ковалентно
Таблица 6.1. Аффинные носители и их специфичность
Носитель/функциональная группа
Специфичность
лиганда
Ковалентная сшивка
Ссылки
Сефароза/СКВг-активированная
А га роза.
2>а
гароза
2).
Агароза
Агароза
II /=^ 'O-C-N^ji
'V3
-соон
2) Полиакриламид
NH-,
-NHa
-NHj
-NH,
-NHj
-COOH
-COOH
Самопроизвольная реакция
Катализ водорастворимым карбодиимидом
[7]
[186]
[187]
[188]
[188]
[190]
')'z)Агароза,
(Тиольный носитель может иметь защитную группу)
rJ,2).
Ара г03а
^ Полиакриламид^^^. _У-в(он),
^ Полистирол Ын-Ц>^в (он),
') Фирма Pierce. г) Фирма Bio-Rad.
-SH Может потребоваться активация сульфгидрильным реагентом [191]
-Алкилирующие агенты Самопроизвольная реакция
-SH > [192]
цис-Диолы, например сахара/кофер-менты [1931
То же > [194]
268
Глава 6
пришить к носителю. В некоторых случаях необходимую активную группу можно
специально ввести в лиганд или белок (см. раздел, посвященный модификации
белка, а также табл. 6.4 и 6.5). Выбор носителя обычно определяется
структурой и свойствами лиганда.
Есть еще ряд соображений, которые необходимо иметь в виду, когда в
качестве лигандов используют белки. Во-первых, при ковалентном связывании
белка с носителем следует позаботиться о сохранении активности белка. Для
этого на стадии связывания часто требуется присутствие субстрата,
аналога, простетической группы или каких-либо ионов, необходимых для
проявления функциональной активности. Возможно, эти компоненты придется
добавить и при подготовке аффинного сорбента для хроматографии. Во-
вторых, непрореагировавшие активные группы следует блокировать каким-либо
инертным модификатором (например, этаноламином) до использования
аффинного сорбента. Аминокислоты в качестве блокирующих агентов менее
предпочтительны, поскольку они придают носителю ионообменные свойства. В-
третьих, кроме центров специфического связывания белки имеют также более
обширные области, которые могут действовать как центры гидрофобного
взаимодействия или - что более обычно - как ионообменники. Присутствие
детергента часто приводит к маскировке или заполнению гидрофобных
полостей в белковой молекуле, благодаря чему неспецифические гидрофобные
взаимодействия ослабляются. Чтобы ослабить неспецифические ионные
взаимодействия, бывает полезно включить в буфер хлорид натрия (в
концентрации, например, 0,1 М).
Именно таким способом обычно готовят высокоспецифические аффинные
сорбенты, содержащие пептидные гормоны или антибиотики (гл. 4). Однако на
самом деле эти сорбенты имеют ряд недостатков; наиболее серьезные из них
- это малая емкость, слабая аффинность и жесткие условия (например,
низкие pH), которые часто необходимы для элюирования связавшихся белков.
Поэтому обычно их стараются использовать на более поздних стадиях
очистки. А на начальных этапах фракционирования с успехом применяют
хроматографию на сорбентах, содержащих углеводсвязывающие белки -
лектины, которые очень легко пришиваются к носителю и сохраняют свою
активность в присутствии мягких детергентов [47, 48] (см. обзор [49]).
Благодаря специфичности к разным сахарам лектины можно использовать для
фракционирования гликопротеинов [48, 50], но чаще они связывают
одновременно несколько углеводсодержащих мембранных компонентов (обзор по
лектинам и их специфичности см. в работе [51]). Хотя связавшиеся
гликопро-
Выделение и модификация мембранных белков
269
тенны легко элюируются с помощью разных сахаров, способность одного и
того же углевода взаимодействовать с несколькими лектинами предполагает,
что их специфичность не очень строгая. Выход белка при элюировании, как
правило, весьма высок (>90%), особенно когда работают с лектинами из Lens
culinaris. В то же время конканавалин А, по общему мнению, наименее
эффективен в этом отношении [47, 48, 52]. Вследствие вариабельности
углеводных боковых цепей многих мембранных гликопротеинов индивидуальные
лектины могут связывать только часть из всех разновидностей данного белка
[48]. Этот недостаток можно отчасти преодолеть, используя лектины со
сходной, но достаточно широкой специфичностью. Другой прием, который
оказывается полезным, когда исследуемый белок содержит концевые остатки
сиаловой кислоты, состоит в использовании сравнительно слабо специфичного
лектина или смеси лектинов (например, смеси лектинов из Lens culinaris
или агглютинина из проростков пшеницы), что позволяет связать большую
часть мембранных гликопротеинов. Несвязавшиеся сиало-содержащие белки
