Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Филдс Б.Н. -> "Вирусология: В 3-х т. Том 1 " -> 90

Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.

Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С. Вирусология: В 3-х т. Том 1 — М.: Мир, 1989. — 492 c.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка): virusologiyat11989.djvu
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 224 >> Следующая

Физические и биохимические карты
На генетической карте можно видеть относительное положение специфических мутаций в геноме, но она не дает никакой информации о генах (и генных продуктах, кодируемых в них), расположенных в соответствующих участках генома. Кроме того» некоторые РНК-содержащие вирусы не рекомбинируют со сколько-нибудь заметной частотой, так что их мутации не картируются. Для картирования мутаций, генов и генных продуктов на физических картах геномов разработан ряд методов. Эти методы, основанные скорее на биохимических, чем на гене* тических приемах, можно использовать для создания карт геномов без рекомбинации и без мутаций. Ниже рассматривается ряд методов физического и биохимического картирования.
Рестрикционные карты
Создание физических карт геномов ДНК-содержащих вирусов началось после того, как в практику вошли рестрикционные эндонуклеазы [23]. Эти ферменты расщепляют ДНК в определенных участках нуклеотидной последовательности, и сайты расщепления могут служить контрольными точками в геноме, расстояния между которыми известны. Стратегия рестрикционного картирования состоит в расщеплении хромосомной ДНК подходящим ферментом и последующем определении размера и порядка расположения образующихся фрагментов в хромосоме.
После этого контрольные точки, представляющие собой сайты* расщепления на рестрикционной карте, можно использовать для картирования разнообразных молекулярных маркеров, например точки начала репликации ДНК [24] и кодирующих областей специфических мРНК [125]. Подробные рестрикционные карты с использованием довольно большого числа рестрикционных эндонуклеаз были составлены для всех ДНК-содержащих вирусов; эти карты оказались чрезвычайно ценными для молекулярных исследований этих вирусов. Рестрикционное картирование-выявило многочисленные особенности организации геномов ДНК-содержащих вирусов: например, было показано, что у HSV геном устроен очень сложно: он характеризуется повторяющимися последовательностями и инверсией сегментов [161]. Рестрикционные карты ДНК-копий генов и целых геномов РНК-содер-жащих вирусов делают эти последовательности доступными для разнообразных манипуляций возможных на ДНК [106].
Физические карты
Знание рестрикционных карт ДНК-геномных вирусов позволило провести быстрое картирование многих генетических маркеров, особенно /s-мутаций, и выявить их физическое положение в хромосоме. Мутации выявляют на физической карте с помощью ряда методов, которые представляют собой варианты одной основной стратегии: спасение мутанта соответствующим рестрикционным фрагментом дикого типа. У SV40 получены частичные гетеродуплексы, содержащие одну цепь—индивидуальный рестрикционный фрагмент ДНК дикого типа, а другую — полноразмерную одноцепочечную ДНК /s-мутанта. Эти гетеродуплексные ДНК использовали для трансфекции клеток, после чего потомство анализировали на присутствие дикого типа. Спасение /s-мутаций осуществлялось только тем рестрикционным фрагментом^ который перекрывал последовательность, содержащую мутацию,, позволяя картировать последнюю между сайтами расщепления, расположенными на концах этого фрагмента [82]. У аденовирусов и герпесвирусов физические карты были составлены путем анализа /5+-потомства, полученного при межтиповом скрещивании /s-мутантов, имеющих различные рестрикционные карты (рис. 7.3,Л). Были составлены рестрикционные карты* ^-рекомбинантного потомства, а совместное распределение определенных фрагментов с рекомбинантным фенотипом позволило поместить мутации в эти фрагменты [53, 95]. /s-Мутации картированы также при помощи варианта метода спасения маркера, в котором, мутантные геномы смешивали с индивидуальными рестрикционными фрагментами дикого типа, и этой смесью трансфицировал» клетки. Спасение маркера регистрировали при рекомбинации с
фрагментами дикого типа только в том случае, если эти фрагменты перекрывали место мутации ,[101]. Когда мутации нанесли и на генетические, и на физические карты, было отмечено хорошее соответствие этих карт.
При составлении физических карт с помощью рестрикционного анализа рекомбинантного потомства, полученного при меж-типовом скрещивании, удобным маркером могут служить полиморфные белки. Косегрегация рестрикционного фрагмента со специфическим 'белковым маркером позволила локализовать на физической карте кодирующие последовательности многих белков [95]. Этим методом можно картировать специфические кодирующие последовательности белков без какой-либо информации о них, за исключением электрофоретической подвижности.
Транскрипционные карты
Составлены карты, показывающие участки генома, кодирующие специфические мРНК. Эти карты были получены в два этапа: а) сначала мРНК, кодируемые определенным участком вирусного. генома, отбирали путем гибридизации с 'индивидуальным рестрикционным фрагментом ДНК; б) затем белки, кодируемые этой мРНК, идентифицировали при помощи трансляции in vitro. Таким образом можно идентифицировать специфические мРНК и белки, соответствующие последовательностям в индивидуальном рестрикционном фрагменте [85].
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 224 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed