Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Филдс Б.Н. -> "Вирусология: В 3-х т. Том 1 " -> 83

Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.

Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С. Вирусология: В 3-х т. Том 1 — М.: Мир, 1989. — 492 c.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка): virusologiyat11989.djvu
Предыдущая << 1 .. 77 78 79 80 81 82 < 83 > 84 85 86 87 88 89 .. 224 >> Следующая

Применительно к вирусам с сегментированным геномом трехфакторные скрещивания не имеют широкого распространения. Это связано с тем, что рекомбинация проходит по механизму обмена сегментами. Сцепленными оказываются только те маркеры, которые расположены в одном сегменте генома, а поскольку в этих системах рекомбинаций внутри сегментов не наблюдается, такое сцепление оказывается абсолютным. Так, при скрещивании типа tsXtsY+Z+xtsX+tsYZ~ маркер Z будет распределяться случайным образом, если маркеры X, У и Z расположены в разных сегментах генома. Если, например, Z+ был бы в том же сегменте, что и tsY+, то все ^+-рекомбинанты были бы Z+ из-за абсолютного сцепления между tsY+ и Z+.
Трехфакторные скрещивания использовали в многочисленных исследованиях с применением мутантов вирусов животных. Например, мутацию синцитиальной морфологии бляшек использовали в качестве неселектируемого маркера в трехфакторных скрещиваниях ^s-мутантов HSV-1 [11]. Круг хозяев, определяемый хелперной функцией Ad2+ND1, использовали в качестве
маркера в трехфакторных скрещиваниях между /s-мутантами аденовируса типа 5 и Ad2+ND1 [53]. У вируса полиомиелита в трехфакторных скрещиваниях /s-мутантов использовали мутацию резистентности к гуанидину [19]. Мутант, индуцирующий вирусный белок с измененной электрофоретической подвижностью, использовали в качестве неселектируемого маркера в трехфакторных скрещиваниях /s-мутантов реовируса [21]. Таким образом, в качестве неселектируемого маркера в трехфакторных скрещиваниях /s-мутантов может быть использована практически любая мутация. Однако совершенно 'необходимо показать, что при температурном отборе, который применяют к /s-мутантам при скрещивании, маркер на самом деле является неселектируемым.
Многофакторные скрещивания
Исследования вирусов животных с использованием более чем трех маркеров в каждом из родителей относительно немногочисленны в основном из-за сложности получения множественных мутантов. Несколько работ выполнено с использованием /s-признака, морфологии бляшек, резистентности к ингибиторам и некоторых других биохимических признаков в различных сочетаниях. В одном из таких исследований удалось выявить ранее не замеченное сцепление маркеров у HSV-1 [63].
Межтиповые скрещивания
В течение последних 10 лет в генетических исследованиях в качестве двух партнеров при скрещивании часто применяли различные серотипы или штаммы одного и того же вируса. Как правило, в этих скрещиваниях используют /s-мутации в одном или обоих партнерах. Вместе с тем межтиповые или штаммовые различия двух родителей дают большое число дополнительных удобных маркеров для скрещивания. Следовательно, межтиповое скрещивание — это особый случай многофакторного скрещивания, в котором для определения распределения неселектируе-мых маркеров в рекомбинантном потомстве серотипо- или штаммоспецифические- признаки требуют биохимического или биологического анализа.
Чаще всего в качестве маркеров используют серотипо- и штаммоспецифические различия в электрофоретической подвижности нуклеиновой кислоты. У вирусов с ДНК-геномом маркерами нуклеиновой кислоты служат различной величины фрагменты, получаемые при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами. У вирусов с сегментированным геномом наблюдается естественный полиморфизм, который выражается в разных скоростях миграции геномных сегментов вирусов, используемых в качестве родительских. На рис. 7.3 приведен пример ис-
Серотип х
М1
-*—4- X
Серотип у
J
~Х----Z------[ТТ
мг
М1
S-------X--------1 1~Т-----ТГ
М2
I
тг
Тип Тип
3 2
Л_________—Х-.
"XX
Серотип х Серотип у
/5+-Реассортанты
Рис. 7.3. Схема межтиповых скрещиваний между мутантами ДНК-содержаще-го вируса (в А аденовируса, [53]), и РНК-содержащего вируса с сегментированным геномом (в Б реовируса). Скрещиванию подвергали /s-мутанты Ml и М2, принадлежащие к различным серотипам, после чего отбирали /«+-рекомби-нанты. В случае аденовируса (А) для каждого рекомбинанта определяли рестрикционную карту. Распределение рестрикционных фрагментов от обоих родителей позволяет выявить положение /s-мутации каждого родителя. В случае реовируса (Б) выясняли родительскую принадлежность каждого сегмента. Распределение сегментов с ts+-фенотипом позволяет сделать вывод о расположении /s-мутаций в сегментах обоих родителей.
пользования размера фрагментов нуклеиновой кислоты или о.ко-рости миграции сегментов в качестве маркеров в сочетании с /s-мутациями для вирусов, содержащих ДНК, или РНК-вирусов с сегментированным геномом. Два /s-мутанта скрещивают и отбирают /5+-рекомбинантное потомство. В случае ДНК-содержа-щих вирусов (рис. 7.3, А) ДНК каждого /$+-рекомбинанта расщепляют рестрикционной эндонуклеазой и продукты сравнивают при помощи электрофореза с рестрикционными фрагментами каждого из родительских штаммов. При этом сравнении могут быть идентифицированы фрагменты, полученные от каждого из родителей. Обычно у /5+-рекомбинанта находится один фрагмент, который не идентичен ни одному из фрагментов родительских штаммов. Этот фрагмент — составной: он содержит нуклеотидные последовательности от обоих родителей и соответствует месту перекреста. В случае РНК-содержащих вирусов с сегментированным геномом (рис. 7.3, Б) с помощью электрофореза сравнивают РНК /5+-рекомбинантов и родительских /s-штаммов. В обоих случаях можно определить долю генома каждого родителя в геноме рекомбинанта. Рестрикционный фрагмент или сегмент генома, содержащий /s-мутацию, определяют благодаря тому, что он исключается из всех ^-рекомбинантов. Анализ распределения таких фрагментов или сегментов у большого числа /5+-рекомбинантов позволяет точно идентифицировать фрагмент или сегмент у каждого партнера, содержащий маркеры, против которых шел отбор. В результате можно точно физически картировать /s-мутации в ДНК-геноме; кроме того это единственный способ локализации мутаций в сегментах вирусов с сегментированным геномом.
Предыдущая << 1 .. 77 78 79 80 81 82 < 83 > 84 85 86 87 88 89 .. 224 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed