Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Некоторые свойства ^s-мутантов заслуживают упоминания. ^s-Мутанты дают полноразмерные белки, которые имеют ту же иммунологическую специфичность, что и белки дикого типа. Про ^s-мутанты часто говорят, что они «текут». Это означает, что при непермиссивной температуре сохраняется некоторая функциональная активность, хотя функция нарушена настолько, что образуется очень мало инфекционного вируса. Тем не менее при пермиссивной температуре ^s-мутанты редко функционируют с той же эффективностью, что и дикий тип. Это часто осложняет получение препаратов мутанта с высоким титром, поскольку ре-вертанты к дикому типу, хотя и редки, но имеют большое преимущество в росте даже при пермиссивной температуре. Если te-мутация расположена в структурном гене, то вирионы, полученные при пермиссивной температуре, могут оказаться термолабильными. Неструктурные белки, несущие ^s-мутацию, могут быть термолабильными или устойчивыми к теплу, причем последнее относится к случаю, когда они синтезированы и свернуты в стабильную биологически активную конформацию при пермиссивной температуре до переноса в условия с непермиссивной температурой.
Холодочувствительные мутанты
Холодочувствительные (cs) мутации с успехом применяли в •прокариотических системах в сочетании с ^s-мутациями для выявления периодов работы определенных генов. Считали, что cs-мутанты могут быть полезны также и у вирусов животных. Однако необходимость использования существенно более низкой, чем оптимальная, непермиссивной температуры делает их применение в системах вирусов животных нецелесообразным.
Делеционные мутанты
Спонтанные и индуцированные делециоиные мутанты выделены для многих вирусов. Спонтанные делеционные мутации [10] накапливаются в вирусных популяциях, пассируемых 'при высокой множественности заражения '[160, 171]. Разработано несколько процедур для получения делеционных мутаций, зачастую в заранее намеченном месте генома [71, 81]. Во многих делеционных мутантах утеряны важные участки, поэтому для их пассирования требуется присутствие вируса-помощника. В других случаях, когда утрачены несущественные участки генома, делеционные мутанты жизнеспособны и могут размножаться без помощника. Делеционные мутанты удобны при картировании специфических функций и белков в вирусном геноме [71, 81].
Другие маркеры
В различных системах с вирусами животных применяли и многие другие маркеры. Мутанты, устойчивые к ингибиторам,, оказались полезными для картирования генома вируса полиомиелита [20] и исследований генов тимидивкиназы и ДНК-поли-меразы HSV [141]. В последнее время в качестве генетических маркеров при изучении молекулярных основ этих явлений у ряда вирусов стали использовать различия в вирулентности или специфических патогенных свойствах разных штаммов вирусов [132]. Полезным генетическим маркером в ряде вирусных систем являются также различия в электрофоретической подвижности нуклеиновых кислот и белков.
Использование /s-мутантов . для анализа функций гена
Характеризация /s-мутанта в отношении синтеза вирусных нуклеиновых кислот и белков часто позволяет найти измененную специфическую функцию и таким образом выявить вирус-опецифическую активность. Мутанты могут быть исследованы при непермиссивной температуре на синтез дочерних геномов,, вирусной РНК и вирус-специфических ферментов и белков. Мутанты можно также проверить на «специфические дефекты в сборке дочерних вирионов и вирус-опецифические воздействия на синтез макромолекул клетки-хозяина. В общем хотя с каждым мутантом связан свой фенотип, мутанты могут иметь изменения сразу в нескольких этапах метаболизма макромолекул или сборки вирусов по сравнению с диким типом. Такой плейотропный фенотип индивидуальных мутантов может быть следствием нескольких возможных действий мутации, а) Мутация может быть
не полностью летальной, т. е. «текучей», или лики-мутацией, и вследствие этого только частично блокировать соответствующую функцию, б) Мутация может быть истинно плейотропной, т. е. затрагивать несколько функций вируса, в) В результате -нарушения мутацией одной функции может начать функционировать альтернативный метаболический путь, г) Мутант может содержать несколько мутаций и поэтому быть дефектным по нескольким функциональным путям. Несмотря на эти осложнения, 'изучение функциональных дефектов, связанных с ^-мутациями, дало массу полезной информации о функциях -индивидуальных вирусных генов.
После выявления специфической функции, нарушаемой ts-мутацией, можно определить время в репликативном цикле вируса, когда эта функция реализуется. Этого достигают в опытах по (изменению температуры, при которой выращивается вирус. Такие опыты ставятся следующим образом [37]. Культуру, зараженную при высокой множественности, инкубируют вначале при пермиссивной (опыты shift-up) или непермиссивной температуре (опыты shift-down) ;и через определенные промежутки времени переносят соответственно в условия непермиссивной «ли пермиссивной температуры. По завершении цикла размножения вируса все культуры анализируют на продукцию инфекционного вируса. Мутанты с дефектными ранними функциями дают хороший выход в опытах типа shift-up и плохой в опытах типа shift-down. В том случае, если ^s-дефект реализуется поздно в репликативном цикле, наблюдается обратная ситуация. Сочетание опытов типа shift-up и shift-down позволяет довольно точно определить время реализации мутантной функции в репликативном цикле.
