Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
неизвестна, например варианты по нейтрализации сыворотками-В большинстве современных генетических вирусологических исследований обычно имеют дело с мутантами, которые отличаются от дикого типа по известным генетическим параметрам; в связи с этим другие термины встречаются не часто.
Спонтанная мутация
Некоторые вирусы дают значительную долю мутантов при пассировании в отсутствие каких-либо известных мутагенов. Эти спонтанные мутации накапливаются в геномах вирусов и приводят к изменчивости фенотипа, которая является объектом селективного давления в ходе эволюции вируса. Скорости спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах низки; они составляют 10~8— 10~п на каждый включенный нуклеотид. У РНК-содержащих вирусов скорости спонтанного мутагенеза значительно выше, порядка 10-3—10~4 на каждый включенный нуклеотид. Считают» что более высокие скорости накопления мутаций обусловлены низкой точностью репликации РНК-геномов, вероятно связанной с отсутствием у РНК-репликаз корректирующей активности, которая присуща ферментам, реплицирующим ДНК [61]. Таким образом, в то время как геномы ДНК-содержащих вирусов относительно стабильны, этого нельзя сказать об РНК-содержащих вирусах, т. е. высокие скорости спонтанного мутагенеза делают концепцию дикого типа применительно к ним довольно шаткой. Тем не менее данные, полученные на системе фага Q(3, показали, что в равновесии дикий тип доминирует в популяции, поскольку он реплицируется быстрее, чем спонтанно возникающие мутанты [27]. К сожалению для генетиков, ряд факторов стимулирует неравновесие в популяции геномов [61], и эти факторы часто способствуют накоплению мутантов в популяции. Из-за спонтанного мутагенеза трудно поддерживать гомогенность популяции вируса, будь то дикий тип или мутант. Для того чтобы обойти эту трудность, вирусы периодически, реклонируют, однако мутанты часто возникают и в ходе образования бляшки, и в ходе роста вируса, поэтому бывает трудно получить генетически однородные препараты вируса с высоким титром [13, 163].
Как отмечалось выше, скорость спонтанного мутагенеза особенно высока в РНК-геномах. Например, популяции вируса ньюкаслской болезни содержат мелкобляшечные мутанты с частотой от 3 до 7% [52]. Для вируса везикулярного стоматита частота перехода к ^s-фенотипу равна 1—5% [105]. Напротив, для ДНК-содержащих вирусов частота спонтанного мутагенеза значительно ниже. Для вируса оспы кроликов обнаружено менее 0,1% спонтанных ^-мутантов [124]. В большинстве случаев скорость спонтанного мутагенеза настолько низка, что не заслужи-
вает специального обсуждения. Лишь в нескольких случаях скорость спонтанного мутагенеза у ДНК-содержащих вирусов составляла до 1 % [36].
Индуцированные мутации
Большая часть мутантов, выделенных в ходе исследования вирусов животных, получена из популяций дикого типа, обработанных мутагенами. Мутагены обычно применяют для того, чтобы увеличить частоту мутаций в популяции, после чего мутанты подвергают скринингу с помощью подходящего селективного давления. Основной проблемой, связанной с использованием мутагенов, является подбор подходящей дозы, так чтобы частота мутаций с требуемым фенотипом увеличивалась, но вероятность множественных мутаций в индивидуальном геноме была минимальна. Поскольку применение большинства мутагенов приводит к потере инфекционное™ или к снижению урожая вируса, для каждой комбинации вирус — клетка — мутаген следует получать кривую зависимости действия от дозы мутагена. Из такой кривой можно рассчитать число летальных «ударов» в среднем на геном, пользуясь распределением Пуассона. Однако, поскольку многие мутации не являются летальными, число летальных ударов при данной дозе мутагена оказывается абсолютно минимальным числом мутационных событий, индуцированных мутагеном при этой дозе. Как правило, желательно получить мутанты, которые отличаются от дикого типа только одной мутацией. Для того чтобы сделать максимальной вероятность выделения мутантов, содержащих только одну мутацию, отбор ведут при наиболее низкой дозе мутагена, дающей достаточную частоту мутаций с желаемым фенотипом.
В системах с вирусами животных было использовано множество различных мутагенов, но все они входят в небольшое число классов, определяемых по механизму мутагенеза. Эти механизмы подробно рассмотрены в обзорах [28, 29, 44] и поэтому здесь описываются лишь в-общих чертах. Мутагены одного класса, обычно называемые мутагенами in vitro, действуют путем химической модификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирусной частице. Азотистая кислота дезаминирует основания, в первую очередь аденин, с образованием гипоксантина, который при последующей репликации спаривается с цитозином. В результате действия азотистой кислоты на аденин происходит транзиция от АТ-пары к GC-nape. Азотистая кислота дезаминирует также цитозин, приводя к транзиции CG—>-ТА. Другим мутагеном in vitro является гидроксиламин; он реагирует специфически только с цитозином и вызывает транзицию CG—>-ТА. Большой класс мутагенов in vitro представлен алкилирующими аген-
