Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Вероятно, в делециях, заменах, дупликациях, ведущих к образованию различных ДИ-геномов, участвует несколько механизмов рекомбинации ДНК. Приобретение ДИ-геномом фрагментов ДНК клетки-хозяина, по-видимому, связано со способностью этих вирусов интегрировать с ДНК клетки-хозяина, но это еще до конца не выяснено [120]. Норкин и Тиррелл [117] показали, что весьма разнообразный набор ДИ-частиц SV40 может образоваться из бляшечного изолята, достоверно свободного от ДИ-частиц. Многие из ДИ-частиц содержат повторяющиеся участки начала репликации (ДИ-геномы этого класса, вероятно, накапливаются быстрее других), а некоторые—последовательности ДНК клетки-хозяина. Но все-таки авторы полагают, что у SV40 нет
тенденции к преимущественному образованию каких-либо вариантов или классов вариантов ДИ-частиц.
О’Нейл и др. [118] выделили ДИ-частицы SV40 двух интересных видов из персистентно зараженных клеток. ДИ-частицы одного из них содержали все или почти все ранние последовательности SV40, фланкированные множеством участков начала и конца репликации, а ДИ-частицы другого — поздние последовательности SV40, также фланкированные множеством таких участков. Несмотря на то что ДИ-частицы этих двух видов ин-капсидированы раздельно, вместе они могут продуктивно заражать клетки почек обезьян в отсутствие полного стандартного вируса. Молекулярные клоны этих ДИ-геномов показали такую же зависимость друг от друга при продуктивной трансфекции. В сущности эти два дефектных генома SV40 представляют собой новый двухсегментный инфекционный вариант вируса SV40, возникший и отобранный в процессе персистентной инфекции. Очевидно, их ранние и поздние гены транскрибируются и компле-ментируют друг друга достаточно эффективно, для того чтобы взаимно поддерживать репликацию и инкапсидацию. По-видимому, присутствие множества участков терминации предотвращает подавление эффективной транскрипции, вызываемое множеством участков инициации, благодаря чему сохраняются репликативное преимущество и способность к индукции вирусной интерференции, обеспечиваемые множеством участков инициации репликации [118]. Ясно, что эти ДИ-частицы должны быть способны к эволюции независимо от стандартных геномов SV40, а также к интерференции и генетическому взаимодействию с ними.
Джонсон и др. [7] проанализировали нуклеотидные последовательности рекомбинационных соединений у 16 ДИ-частиц SV40 и на основании этих данных в сочетании с известными последовательностями вирусного генома восстановили родительские последовательности, участвующие в каждом рекомбинационном событии. Они не нашли сходства последовательностей на концах разных делеций или выраженной гомологии между родительскими последовательностями, соседствующими с делениями. Поэтому эти авторы-исключили гомологичные рекомбинации и любые сайт-специфические рекомбинационные механизмы. Они предположили, что вероятным механизмом образования дефектных геномов SV40 являются репарация и лигирование линейных ДНК, образующихся под действием неспецифических клеточных нуклеаз.
И наконец, следует отметить, что полученные методом генной инженерии дефектные геномы SV40, содержащие встроенные чужеродные гены, стали важным инструментом молекулярного клонирования в эукариотических клетках.
Герпесвирусы
Очень большие сложные геномы герпесвирусов также легко образуют ДИ-частицы, содержащие делеции, перестройки и повторы вирусных последовательностей. Имеются сообщения о наличии ДИ-геномов у ряда герпесвирусов, в том числе у вируса простого герпеса (herpes simplex virus, HSV) [48, 150, 151], вируса герпеса лошадей [35, 56], цитомегаловируса [148] и т. д. Френкель и др. охарактеризовали сегменты вирусного генома, необходимые ДИ-частицам вируса герпеса для того, чтобы они могли эффективно реплицироваться и инкапсидироваться [150, 151]. Все ДИ-частицы HSV, которые были исследованы, содержат повторяющиеся последовательности ДНК, включающие фрагменты концевого участка S-плеча генома. При введении путем трансфекции в зараженные стандартным вирусом-помощником клетки мономерных повторов с мол. массой 5,5-106, отщепленных от повторяющихся последовательностей ДИ-генома, исходные мономерные единицы реплицировались и регенерировали конкатемеры размером в полный геном (мол. масса 100-106), состоящие из исходных повторов, собранных по принципу «голова— хвост» [150]. Это, вероятно, является результатом поддерживаемой вирусом-помощником репликации по механизму катящегося кольца.
Дальнейшие исследования показали, что кроме повторов, содержащих участки начала репликации, в состав геномов ДИ-частиц входят сигнальные последовательности, кодирующие расщепление конкатемеров вирусной ДНК для упаковки. Отщепленные повторяющиеся единицы с размерами от 5,5-106 Да (мономеры) до размера полного генома (дефектные конкатемеры) обнаружены упакованными в капсиды, накапливающиеся в ядре [151]. Однако покрываются оболочкой и переносятся в цитоплазму как зрелые капсиды только дефектные конкатемеры размером в полный геном (— 100-106 Да). Механизм столь избирательного созревания неясен. Связь между расщеплением и морфогенезом прослеживается также у вируса псевдобешенства [95]. Спэт и Френкель [143] использовали повторяющиеся единицы дефектных геномов HSV, для того чтобы получить клонирующий вектор, который в присутствии HSV-помощника может в эукариотических клетках реплицировать большую вставку чужеродной ДНК. Этот вектор является химерой повторяющихся ДИ-единиц HSV, присоединенных к бактериальной плазмиде ркс7, что делает возможным его перенос от бактерий к эукариотическим клеткам и обратно.
