Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
белок-белковая мицелла
Мембрана |
о;
Комплекс
белок-
детергент
•w4 .
Комплекс \ липид-детергент
\
В
Липидный
бислой
\ Ззякоривакиций -Цитоплазмати- пептид ческмй домен
пептид
Реконструированная липо-сома с встроенным белком
Растворимый гликопро-геин_(гемагглютинин, выделенный с помощью бромелаина)
Мембрана
Заякоривающий
пептид
'.Рис. 4.10. Выделение мембранных белков. А. Неионный детергент, присутствующий в избытке, растворяет мембранные белки, связываясь с гидрофобными (волнистая линия) участками белков и липидов. Б. После удаления детергента -з отсутствие липидов образуются белок-белковые мицеллы, формирующиеся • благодаря взаимодействию гидрофобных якорных пептидов. В. После удаления детергента в присутствии липидов происходят восстановление липидных бислойных пузырьков и встраивание белков в .искусственную мембрану. Г. В некоторых случаях при обработке мембранных белков протеазами отщепляется гидрофобный якорный пептид вблизи поверхности мембраны, освобождая растворимый активный фрагмент гликопротеина. (На рисунке приведен пример ¦выделения гемагглютишша вируса гриппа с помощью бромелаина.)
билизации представлены на рис. 4.10. Неионные детергенты солюбилизируют мембранные белки, связываясь с гидрофобной частью белков и липидов. При избытке детергента каждая молекула белка и липида оказывается включенной в отдельную мицеллу детергента. После удаления липидов остается монодис-персный раствор комплекса белок—детергент. Поскольку большинство неионных детергентов не денатурируют белки, эти комплексы стабильны и функционально активны [46]. Если детергент удалить в отсутствие липидов, то гидрофобная якорная •часть гликопротеина агрегирует и образует белок-белковую мицеллу (рис. 4.10,5). Если детергент удалить в присутствии липидов, то образуются бислойные липидные везикулы с включенными в них гликопротеинами (рис. 4.10,5). Таким образом, в водной фазе никогда не обнаруживается гидрофобная заяко-ривающая пептидная часть гликопротеинов; она всегда находиться либо в гидрофобном липидном бислое, либо окружена гидрофобными участками молекул детергента. На рис. 4.11 представ-
'ис. 4.11. Белок-белковые мицеллы гемагглютинина вируса гриппа, получение после удаления детергента из очищенного препарата белка [59].
[ена электронная микрофотография белок-белковых мицелл ге-1агглютинина вируса гриппа, полученных после удаления детер-ента из монодисперсного раствора белок-детергентных комп-[ексов [59]. Благодаря своей звездчатой структуре белок-белко-ые мицеллы вирусных гликопротеинов оказываются весьма юлезными при получении вакцин и широко используются в био-шмических исследованиях [8, 14, 47].
Для исследования наружного гидрофильного домена мембранных белков в ряде случаев .можно удалить заякоривающий [ептид путем протеолитического расщепления мембран или бел-сово-детергентных комплексов (рис. 4.10, Г) [15, 21, 39, 97, 100]. 1ри этом нередко гидрофильная часть молекулы высвобождает-:я в виде не только растворимого, но и активного белка. Поскольку разные участки вирусного гликопротеина находятся в
л —
*1 а х
36 я з
5%о"в
ГО 03 $ "2е
Csl
С
ZC
о о л х ?*•
/о7
-С
зс
ГС
о
3 о cj
? О ' * * rt’g «§ >* о
¦Q QJ
К 9* СО Я
СО (-4
Л я
& S
>> т <9
00 К СО О
2 а
w-f
bJO s
с
о
bJOC?
й
Е со
ГЗ
5 Я 5 w я н
О, СО и f-, о я о а'—'
а.и я ш « S о
Я К(
и
S *Я
а я s ?Г
U2
Я св
Ь§
св О.
3 8 о м
5 8® &>3
S « ч S
О со 2 ^
5 VO
4, S К g
a: S <и
«<М
о-С
810
* со
О)
о -
* й' CJ ж
а> н oj
3 с\}
5* со я н
Й о О)
Э °И «5 -о и
X Е-
ЛД D Я
2sh
• п ^
^ §S
а аЯ к s 3 а>
а- ж г
трех разных окружениях — внеклеточное пространство, липидный бислой и цитоплазма — резонно предположить, что молекула гликопротеина подразделяется на домены, независимо приобретающие такую конформацию, которая обеспечивает им стабильность в соответствующей среде. Это предположение подтверждается тем, что можно удалить пептиды якорной части гликопротеина, не изменив активности наружного домена.
Первичная структура вирусных гликопротеинов
Методом секвенирования белков и нуклеиновых кислот были определены аминокислотные последовательности мембранных гликопротеинов вируса гриппа, вирусов Синдбис, леса Семлики, везикулярного стоматита, бешенства и ряда РНК-содержащих опухолеродных вирусов [12, 33, 63, 76, 77, 90]. Эти последовательности обладают рядом сходных особенностей, которые проиллюстрированы на примере гемагглюти-нина вируса гриппа на рис. 4.12; первичная структура этого гемагглю-тинина была определена у 15 штаммов [115]. Большинство последовательностей содержат по два участка незаряженных, в основном гидрофобных, аминокислот: сигнальную
N-концевую последовательность и заякоривающую С-концевую. В зрелых белках сигнальный пептид в норме отсутствует — его отщепляет сигнальная пептидаза. Исключением является нейраминидаза вируса гриппа: не имея С-концевого «якоря», она сохраняет N-концевую гидрофобную последовательность и, вероятно, закрепляется с ее помо-
