Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Хотя механизм интеграции вирусной ДНК остается неизученным, анализ последовательностей клонированных провирусов, а также сайта их интеграции с хозяйской ДНК позволил установить как структуру провирусной ДНК, так и те изменения, которые происходят, в клеточных последовательностях, прилегающих к месту интеграции, в ходе -инфекции. Вирусная ДНК интегрирует с сохранением ориентации, характерной для свободной линейной провирусной ДНК: LTR-gag-pol-env-LTR [88, 152]. Одгаако в клеточном геноме существует много мест, в которые может встроиться провирус [163]. Последовательности, а которые он встраивается, обычно не содержат гомологий с вирусной ДНК. Более того, у провирусов нет тенденции включаться в уже существующие в геноме' последовательности эндогенных или экзогенных ретровирусов. Эти данные свидетельствуют о том, что провирус может внедриться в любое место хозяйской ДНК.
Есть много сходного между интеграцией ДНК ретровирусов и подвижных генетических элементов низших организмов [82, 87, 161, 163, 187]. При интеграции провирус теряет по 2 концевых муклеотэда с каждого конца, а -участок хозяйской ДНК (длиной от 4 до 6 Ьр в зависимости от вида' вируса), в который встраивается провирус, дуплицируется. В результате и справа, и слева от включенного' провируса находится клеточная нуклео-
тиД'Ная последовательность, которая до 'интеграции была представлена лишь одной копией.
Часть линейных свободных молекул вирусной ДНК в ядра'х превращается в ковалентно замкнутые кольца, но неизвестно, являются ли они предшественниками интегрированных провиру-ОО'В [159]. Количество кольцевых провирусов нарастает в первые 2—3 дня после заражения и может достигать 100 копий на клетку. Каждый такой провирус содержит две или одну «опию LTR (рис. 13.2). Еще через несколько дней эти ««интегрированные ДНК исчезают. Хотя кольцевые провирусы инфекционны и удобны для клонирования [70], их уделыная инфекционность значительно ниже, чем у линейных форм. В опытах по трансфекции кольцевые ДНК в отличие от линейных не интегрировали в правильной (относительно своих LTR) ориентации [20].
Фаза IV: экспрессия вирусной ДНК
В хронически, инфицированных клетках вирусная РНК считывается с интегрированных провирусов. Свободная ДНК может экспрессироваться, но для сохранения проаируеа необходима его интеграция. В клетках, содержащих несколько провирусов, обычно бывает трудно 'разобраться, какой из них транскрибируется. Разные -клетки одной популяции могут существенно (в десятки и сотни :раз) различаться по уровню экспрессии вируса {50, 189].
Провирус является транскрипционной единицей с собственными регуляторными 'последовательностями. Однако экспрессия конкретного провируса зависит как от вирус-специфических, так и от хозяйских факторов, в частности от места интеграции, физиологического состояния клетки и LTR. В отличие от многих других вирусов у ретровирусов продукты экспрессии генома не участвуют в 'контроле их экспрессии, а экспрессия провируса зависит только от хозяйских ферментов. Как и большинство клеточных генов, транскрипционно активные провирусы локализованы в пипометилюрованных местах генома, чувствительных к ДНКазе I [15]. При метилировании in vitro клонированные про-вирусы могут утрачивать инфекционность [115, 167]. Провирусы, локализованные в гиперметилированных областях генома, устойчивых к ДНКазе I, обычно не экспрессируются. Таким образом, нормальные во всех отношениях провирусы могут быть «молчащими», вероятно, потому, что находятся под влиянием фланкирующих последовательностей клетки-хозяина.
Вирус-опециф'ическая регуляция экспрессии осуществляется с помощью LTR [11, 17, 182], несущих промоторы, энханоер транскрипции, сигналы полиаденилирования [55, 62, 111, 205]. Транскрипция начинается на левом конце последовательности R ле-
вого LTR. Как и большинство эукариотических генов, провирусы транскрибируются с помощью клеточной Р Н К - п о л и м ер а з ы II. Вирусные транскрипты полиаденилируются за правым концом последовательности R правого LTR; сигнал полиаденилирования (обычно ААТААА) расположен внутри R примерно за 20 нуклеотидов перед ее правым концом. Итак, транскрипция начинается за левым, а заканчивается добавлением poly (А)-участка, перед правым концом провируса. Область U3 всех LTR содержит также ССААТ- и ТАТАА-участюи или сходные последовательности» входящие в состав промоторов Р Н К -п о ли м ер а з ы II и расположенные непосредственно перед началом транскрипции. Пока неясно, насколько вариации в последовательности промоторного участка LTR влияют на эффективность экспрессии вируса.
В состав LTR входят также элементы, усиливающие транскрипцию (энхансеры) и работающие независимо от своего положения и ориентации [93]. Относительная «сила» энхансера варьирует в зависимости от вида животного или стадии диффе-ренцировюи «леток [49, 106]. Свойством энхансера обладает повторяющаяся последовательность с варьирующей длиной (от 72 до 101 Ьр), которая находится в области U3 перед промотором. Как отмечается в разделе «Патогенность v-ояс-вирусов», эн-хансер может заметно влиять на характер патогенности вируса.
