Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
388 Глава 12
сульфата натрия). По-видимому, такое разнообразие связано с какими-то посттрансляционными модификациями первичных продуктов трансляции. Необычно высокие значения кажущихся мол. масс можно объяснить высоким содержанием в Т-антиге-нах EIA кислых аминокислот и пролина.
В <бласти Е1В идентифицировано три главных Т-антигена: белок , • мол. массой 53К, кодируемый 22S-mPHK, белок с мол. массой 19К, кодируемый 22S- и 13S-MPHK, и белок с мол. массой 20К, кодируемый неидентифицированной мРНК [17, 65, 84, 97, 100, 112, 114, 138, 169, 171, 185, 241, 255, 298]. Реальная мол. масса Т-антигенов 53К и 19К, рассчитанная исходя из нуклеотидной последовательности ДНК, оказалась равной 54,5К и 20,5К [85]. Обнаружилось, что Т-антиген 20К имеет общие с Т-антигеном 53К участки. Следовательно, он должен транслироваться с той же рамкой считывания, что и Т-антиген 53К. Судя по результатам последних работ, в которых использовались антитела к 16 N-концевым аминокислотным остаткам Т-антигена 53К, N-концевые участки белков 20К и 53К Е1В одинаковы [174]. По-видимому, мРНК, кодирующая Т-антиген 20К, образовалась в результате сплайсинга, отличного от такового в случае мРНК, кодирующей Т-антиген 53К.
Все перечисленные Т-антигены Е1 кодируются г-цепью, и соответствующие вирусные мРНК транскрибируются в направлении слева направо. На рис. 12.5 показаны две открытые рамки считывания — URF10 (единицы карты 6,6—5,5) и URF11 (единицы карты 5,1—3,3)—в трансформирующей области Е1 в /-цепи [85]. Соответствующие им белки могли бы иметь мол. массу 14К и 23К. Какие функции выполняют эти предполагаемые белки в процессе трансформации — неясно. Недавно с помощью иммунопреципитации с использованием опухолевой сыворотки Ad2 был открыт новый белок— ПК [144]. Судя по результатам задержки трансляции при образовании гибрида с рестрикционным фрагментом Е Bglll (единицы карты 0—9,4) предполагаемый ген этого белка должен располагаться в /-цепи в трансформирующей области. Возможно, белок ПК образуется с использованием рамки считывания URF10, но чтобы доказать это, нужны дополнительные исследования.
Данные об участии Т-антигенов аденовирусов в трансформации
Трансформирующая область аденовирусов намного сложнее трансформирующих областей SV40 и Ру. Она содержит два транскрипционных элемента Е1А и Е1В, которые кодируют как минимум пять разных Т-антигенов: элемент Е1А — Т-антигены из 243 и 289 аминокислот и элемент Е1В — Т-антигены 19К, 20К и 53К. Недавно были получены чрезвычайно интересные
данные о возможных функциях Т-антигенов. Главный вопрос состоял в том, какие белки, кодируемые Е1, нужны для инициации и поддержания трансформации и в чем состоит их роль. Чтобы ответить на этот вопрос, были проведены эксперименты с мутантами, дефектными по функции трансформации, и опыты по трансформации клеток плазмидами, содержащими различные комбинации нормальных и мутантных фрагментов ДНК Е1А и Е1В. Было показано, что для трансформации нужны по крайней мере три Т-антигена — оба Т-антигена Е1А и Т-антиген Е1В
19К.
Вывод о том, что три этих Т-антигена принимают участие в трансформации клеток, был сделан исходя из того, что а) все трансформированные аденовирусом клеточные линии содержат и экспрессируют на уровне РНК левый сегмент вирусного генома, размер которого составляет 11% длины генома [71, 75]; б) трансфекция клеток почек новорожденных крысят с помощью левого сегмента, составляющего 8% длины вирусного генома (ЯвыЬО-рестрикционный фрагмент Ad5), индуцирует трансформацию [91]. Клетки, трансформированные этим фрагментом, имели тот же фенотип, что и клетки, трансформированные более длинными фрагментами ДНК или целым вирусом [293]. Эти результаты позволяют предположить, что для трансформации нужна область Е1А и левая половина области Е1В.
Дополнительные данные об участии Т-антигенов, кодируемых Е1А и Е1В, в трансформации клеток получены при генетических исследованиях. Были выделены и охарактеризованы дефектные по функции трансформации мутанты с нарушениями в области Е1 [72, 76, 90, 113, 121, 141, 267]. Идентифицированы две ком-плементационные группы /ir-мутантов Ad5 (мутанты по кругу хозяев); одна группа мутаций (hrl) картируется в области Е1А, вторая (Aril) — в области Е1В. Яг-мутанты могут реплицироваться в трансформированной Ad5 линии 293 почечных клеток эмбриона человека, которые экспрессируют область Е1, но в клеточных линиях HeLa и КВ их репликация осуществляется неэффективно. Поскольку обе группы мутантов дефектны по функции трансформации, в трансформации участвуют по крайней мере два гена области Е1 [90]. Если и Т-антигены Е1А, и Т-антигены Е1В нужны для поддержания трансформации, то трансформированные клетки должны сохранять в интактном состоянии те гены, которые кодируют эти белки, и должна осуществляться экспрессия этих генов с образованием соответствующих мРНК и белков. Действительно, сегменты ДНК Е1А и Е1В присутствуют и экспрессируются на уровне РНК [70, 71, 96, 247] и на уровне белка [97, 98, 103, 185] у четырех охарактеризованных клеточных линий, трансформированных Ad2, — F17, 8617, F4 и Т2С4.
