Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Репликация ДНК папилломавирусов в опухолях и трансформированных клетках
Физическое состояние вирусного генома в папилломах и карциномах, индуцированных у кроликов папилломавирусом кроликов Sylvilagus (CRPV), в природных саркоидных опухолях лошадей, где содержатся геномы BPV, и в опухолях человека, содержащих HPV, изучали методом блот-гибридизации ДНК-Практически во всех случаях вирусный геном был представлен в форме единичных неинтегрированных замкнутых кольцевых молекул ДНК, которые в большинстве обследованных опухолей реплицировались в виде эписом; интегрированную форму вирусной ДНК удалось обнаружить лишь в нескольких случаях [297]. В саркоидных опухолях лошадей содержалось до 50 копий эпи-сомных молекул ДНК единичной длины на клетку [6, 158, 159]. Аналогичное количество — от 40 до 50 копий эписомной ДНК CRPV — содержалось в перевиваемых карциномах VX2 и VX7 [66]. В карциномах домашних кроликов были обнаружены большие мультимерные эписомные молекулы ДНК CRPV [297]. В опухолях человека геном HPV, как правило, присутствует в виде кольцевой эписомной ДНК геномного размера, однако в не-жольких случаях были также обнаружены субгеномные фрагменты вирусной ДНК [60, 88, 104, 209, 211, 306].
Индуцируемая BPV-1 очаговая трансформация мышиных клеток в культуре — единственная модельная система, пригодная для изучения трансформации с помощью папилломавирусов. Трансформированные клетки способны расти без прикрепления к годложке и могут вызывать опухоли у мышей nud. Используя нетод подсчета очагов трансформации, удалось локализовать 'ен, определяющий способность BPV-1 индуцировать трансформацию, в Ват Hl/Hind III-рестрикте длиной 5,4 kb, представляющем собой 69% вирусного генома, длина которого составляет 7,9 kb [173] (рис. 12.3). Клетки, трансформированные интактны-«и молекулами вирусной ДНК или- этим фрагментом, содержат множество копий эписомной вирусной ДНК и не содержат инте* рированных последовательностей вирусной ДНК [168]. Клетки, трансформированные интактной ДНК BPV-1, экспрессируют вирусные РНК, закодированные исключительно в вирусном фрагменте длиной 5,4 kb (см. далее).
Рис. 12.3. Генетическая карта, на которой показаны области генома BPV-1, транслируемые с открытыми рамками считывания и кодирующие предполагаемые (исходя из нуклеотидной последовательности ДНК) ранние белки El—Е8 и предполагаемые поздние L1 и L2 [33]. Ранние белки локализованы в сегменте генома, составляющем 69% его длины, который обладает способностью трансформировать мышиные клетки in vitro [173]. Вирусный геном разбит на 100 частей (единиц карты), пронумерованных по часовой стрелке, начиная с уникального сайта расщепления рестриктазой Hpal. Основные открытые рамки считывания, кодирующие предполагаемые белки BPV-1, располагаются в одной и той же цепи ДНК и читаются со всеми тремя трансляционными рамками считывания.
Были сконструированы мутантные ДНК BPV-1, содержащие делеции, и исследована их способность к трансформации культивируемых мышиных клеток. Оказалось, что для трансформации клетки требуется присутствие двух участков вирусной ДНК [197]. Первый участок расположен в некодирующей области вблизи 5'-конца трансформирующего фрагмента (рис. 12.3; единицы карты 85—95) и, очевидно, является регуляторной последовательностью, о чем свидетельствует следующий результат: длинный концевой повтор (LTR) вируса мышиной саркомы Харви, который содержит последовательности, ответственные за усиление, стимуляцию и инициацию транскрипции, функционально заменим 5'-концевым участком трансформирующего фрагмента ДНК BPV. Второй участок расположен в З'-концевой области трансформирующего фрагмента (рис. 12.3; единицы карты 23—55) и, очевидно, кодирует трансформирующий белок (белки) BPV-1. Интересно, что последовательность длиной 59 Ьр„
расположенная на удаленном конце раннего транскрипционного элемента BPV-1 (рис. 12.3; единица карты 55), выполняет функцию активатора экспрессии генов и необходима для трансформации клетки BPV-1 [177].
Делеция участков вирусной ДНК, расположенных между двумя важными для трансформации сегментами, лишает ДНК BPV-1 способности к репликации в виде эписомы. Однако геном с такими делециями сохраняет способность трансформировать клетки [197]. Таким образом, последовательности ДНК, которые кодируют функцию трансформации, независимы от участков, необходимых для репликации эписом. Система BPV-1 представляет собой хорошую модель для изучения вирусных и клеточных функций, нужных для поддержания вирусной ДНК в виде эписомы.
Челночные векторы на основе BPV-1
Используя способность ДНК BPV-1 реплицироваться в виде эписомы, удалось с помощью ДНК-опосредованного переноса генов и последующего отбора трансформированных клеток по морфологическим признакам создать на основе этой ДНК вектор для введения чужеродных генов в клетки мыши [252]. В результате были сконструированы рекомбинантные плазмиды, которые реплицируются в виде эписом как в мышиных, так и в бактериальных клетках [251, 252]. Этот тип вектора, с помощью которого можно переносить гены от млекопитающих к бактериям и обратно, оказался незаменимым для репликации эукариотических генов в бактериях, а также для изучения их структуры, экспрессии и функций в окружении определенных последовательностей в виде неинтегрированной, многокопийной плазмиды. К настоящему времени несколько чужеродных генов введено в мышиные клетки в виде рекомбинантов с вектором BPV и показано, что в трансформированных клетках происходит экспрессия этих генов. К ним относятся гены, кодирующие препроин-сулин крыс [252], бета-глобин [55], бета-интерферон [308] и гормон роста [212] человека. Рекомбинантные BPV, содержащие ген интерферона со специфическими делециями, были использованы для выявления последовательностей ДНК, которые регулируют экспрессию бета-интерферона [307]. Недостаток вектора BPV-1 состоит в том, что с его помощью можно трансформировать только мышиные клетки.
