Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Зоооосх------------------->>С'ООСЖ Вирусная 3 Р-ДНК
Клонированная |
вирусная ДНК Молекулярная гибридизация
>СХ Гибрид клеточной и вирусной 52р-ДНК
Рис. 12.1. А.. Обобщенная схема молекулярных событий, происхо* дящих пр,и трансформации клетки ДНК-содержащими опухолеродными вирусами — членами семейств полиома- или аденовирусов. Вирусная ДНК (вся или частично) встраивается в ДНК клетки-хозяйна. Далее происходит транскрипция вирусных генов, кодирующих трансформирующую функцию; молекулы вирусной мРНК подвергаются процессингу и переносятся в цитоплазму. Здесь они транслируются, в результате чего образуются два функциональных класса трансформирующих белков, или Т-анти-генов. Один класс белков сосредоточен в клеточном ядре; он осуществляет функцию иммортализации первичных клеток, что ведет к образованию клеточных линий. Второй класс белков связан с плазматической мембраной или с цитоплазматическими мембранными структурами; эти белки ответственны за появление у клетки фенотипических цризнаков полной трансформации. Б. Обнаружение вирусных генов в трансформированных клетках. ДНК экстрагируют из трансформированных клеток фенолом после предварительной обработки «смесью лротеазы и РНКазы. Затем ДНК анализируют с помощью молекулярной гибридизации, используя в качестве зонда клонированную вирусную ДНК, меченную in vitro [32Р]-дезоксирибонуклеотидтрифосфатами. Положительная гибридизация, о наличии которой можно судить по образованию радиоактивных гибридных молекул ДНК, показывает, что в трансформированной клетке сохранены последовательности вирусной ДНК.
вирусов человека групп As В и С. В случае папилломавирусов функцию сохранения у клетки фенотипических признаков трансформации обеспечивает уже не интегрированный вирусный геном, а сверхспиральная молекула вирусной ДНК, которая реп-
лицируется в виде эписомы. Хотя прямые доказательства того, что папилломавирусы кодируют некий трансформирующий белок, выполняющий функцию поддержания трансформации, пока отсутствуют, тем не менее, по-видимому, это именно так. . В настоящее, время неясно, как происходит трансформация в случае аарджения, клеток герпесвирусами, т. е. неизвестно, интегрируются ли специфические вирусные гены и осуществляется ли экспрессия каких-то. .трансформирующих белков, отвечающих за регуляцию роста. Неизвестен также механизм индукции опухолей HBV-подобными вирусами. Интегрированная вирусная ДНК всегда присутствует в опухолях печени человека и сурков, но данных о наличии в ней гена, ответственного за функцию трансформации, нет.
В обобщенной схеме, приведенной на рис. 12.1,Л, показано, что вирусная ДНК встраивается в хромосомную ДНК трансформированной клетки. При этом по современным представлениям ни в вирусном, ни в клеточном геномах нет каких-то специфических сайтов интеграции. Интактными должны быть только те части вирусного генома, которые кодируют трансформирующие гены. Именно они должны экспрессироваться в трансформированной клетке. Вирусные трансформирующие гены транскрибируются клеточной РНК-полимеразой II, после чего происходит процессинг и перенос транскриптов к клеточным полисомам. Там они транслируются с образованием кодируемых вирусом трансформирующих белков (опухолевые антигены, или Т-антигены). В настоящее время обнаружено два класса Т-антигенов (или белковых доменов Т-антигенов) с разными биологическими функциями и разной внутриклеточной локализацией. Один класс антигенов локализован в клеточном ядре. Он выполняет функцию иммортализации первичных клеток, которые в результате приобретают способность к неограниченному росту. Второй класс антигенов связывается с плазматической мембраной или ' со структурами мембран цитоплазмы. Он ответствен за появление у клеток свойств, характерных для трансформированного состояния.
Идентификацию и картирование трансформирующих генов опухолеродных ДНК-вирусов проводили: а) с помощью анализа последовательностей вирусных ДНК, присутствующих в трансформированных и опухолевых линиях клеток; б) путем транс-. формации клетки посредством переноса генов с помощью специфических рестриктов вирусной ДНК; в) на основании анализа вирусных мутантов, дефектных по своим трансформационным свойствам. Трансформирующие гены SV40 и Ру расположены в ранней области вирусного генома: у BPV-1 —в сегменте, составляющем 69% длины всего генома, у аденовирусов групп А, В и С — в ранней области 1, расположенной в левом участке, состав-
ляющем 11% длины генома, у герпесвирусов — в одном (HSV-I и EHV-1) или в двух (HSV-2 и HCMV) участках вирусной ДНК.
Работы по изучению организации и экспрессии трансформирующих областей полиома- и аденовирусов показали, что эти вирусы содержат перекрывающиеся гены, которые кодируют семейства частично родственных друг другу Т-антигенов. Таким образом, интерпретация экспериментов по переносу генов ДНК-фраг-ментами осложняется тем, что в них всегда присутствует не один," а несколько генов, кодирующих Т-антигены. Недавно для исследований процесса трансформации клетки и онкогенности были сконструированы плазмиды, содержащие только монофункциональные гены вирусных Т-антигенов. Их применение позволяет прояснить функции отдельных вирусных Т-антигенов и их доменов. Кроме того, эти иследования проливают свет на изменения ростовых свойств, которые наблюдаются во время многоступенчатого процесса перехода первичных клеток сначала в имморта-лизованные, а затем в полностью трансформированные. Далее мы рассмотрим современные представления о молекулярной бйр-логии трансформации клеток различными ДНК-содержащими опухолеродными вирусами.
