Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Итак, сначала клетки «обнажают», экстрагируя липиды неионными детергентами в буфере при физиологической ионной силе. Растворимые белки высвобождаются, и остается самопод-держивающийся переплетенный клеточный скелет. При последующей обработке смесью ионного и неионного детергентов либо 0,25 М сульфатом аммония удаляется цитоскелет. Хроматин удаляют с помощью нуклеаз и последующей элюции с повышением ионной силы. После этого остается ядерная сеть, или матрикс* вместе с промежуточными филаментами [22]. На рис. 11.1 схематически изображена процедура ступенчатой экстракции, при которой прекрасно сохраняется морфология и очень хорошо разделяются биохимические фракции, так что все клеточные белки
, Морфология Интактная клетка
0,5%-ный тритон
Белковая
фракция
Растворимый
белок
1%-ный Тбин40, 0,5^-ный дезоксихолат или 250 мМ (NH^2S04
|(______________ Белки
цитоскелета
ДНКаза 1, РНКаза А, затем _250 мМ (NH4)2S04
Каркас из ядерного матрикса и промежуточных фила-ментов
Белки
хроматина
Белки ядерного матрикса и промежуточных; филамен-тов
Рис. 11.1.Ступенчатая экстракция, позволяющая получить цитоскелетиую основу и комплекс ядерного матрикса с промежуточными филаментами.
оказываются в одной из этих структурных фракций. На рис. Н.2 изображена клетка после всех описанных процедур экстракции, так, как она выглядит в электронном микроскопе при использовании метода нанесения целого объекта. Из этого рисунка видно, что структурный скелет после удаления липидов и растворимых белков по-прежнему поддерживает общую форму клетки и даже ее детальную морфологию. Клетка покрыта белковой оболочкой (пленкой), состоящей из белков плазматической мембраны,
Рис. 11.2. Клетка после всех описанных в тексте процедур экстракции.
большая часть которых остается связанной со скелетной основой и после удаления липидов [5]. Эта плазматическая пленка содержит участки связывания полиовируса, а также, вероятно, других вирусов. В плазматической мембране иногда обнаруживаются вирус-специфические белки, такие как гликопротеин вируса Синдбис или белок src вируса саркомы Рауса, но в основном они удерживаются цитоскелетом в составе плазматической пленки. На рис. 11.2 показано также, как выглядит ядро после удаления хроматина и волокон RNP. Все ядерное пространство заполнено густой сетью белковых филаментов. Их морфология и биохимический состав совсем иные, чем у плазматических волокон.
На рис. 11.3 представлено несколько цитоплазматических структур при разном увеличении. На микрофотографиях отчетливо видны белковые волокна, в то время как с помощью обычной электронно-микроскопической методики удается получить лишь весьма приближенное представление о внутренних структурах клетки. Белковые волокна гетерогенны по своей морфологии и чрезвычайно сложны по составу. В процессе подготовки препаратов для электронной микроскопии микротрубочки могут деполимеризоваться (как в данном примере). Этот процесс удается предотвратить путем стабилизации препаратов таксолом.
Распространено ошибочное представление о том, что клеточный «скелет» состоит из актина, тубулина и белка промежуточных филаментов. На самом деле эти компоненты являются лишь частью скелетных структур; на микрофотографиях видно множество других переплетенных элементов. Анализ скелетных белков с помощью двумерного гель-электрофореза показывает, что в скелете и ядерном матриксе присутствует несколько сотен белков. Актин, тубулин и белок промежуточных филаментов — это •очень важные компоненты, но они составляют всего лишь 10— 15% массы скелета.
Qyftei к ад
Рис. 11.3. Электронно-микроскопические фотографии цитоскелета, полученные без заливки в смолу. А, Низкое увеличение. Б. Среднее увеличение. В. Высокое
ЛШАТТИттлПио
увеличение.
Особый интерес для вирусологических исследований представляет визуализация ядерного матрикса [7, 18, 24, 28, 42]. Очень много споров вызвал вопрос о самом существовании этой структуры, главным образом из-за того, что с помощью обычной методики заливки среза не удавалось визуализировать чисто белковую сеть. На незалитом срезе ядерный матрикс виден совершенно отчетливо. На рис. 11.4 показаны два вида матрикса после удаления хроматина: первый с еще неудаленными волокнами РНК, второй — без них. Морфология и биохимический состав матрикса зависят в определенной степени от метода приготовления препарата. Нами была разработана методика сравнительно мягкой экстракции, в которой используются растворы с низкой ионной силой (0,25 М сульфат аммония) и которая обеспечивает полное удаление белков, связанных с хроматином [15, 23]. О действенности этой методики свидетельствует эффективное отделение компонентов ядра от других компонентов клетки, а сравнительно хорошее сохранение различных структур позволяет предположить, что такие мягкие процедуры могут оказаться полезными и для дальнейших исследований вирусов.
Метаболизм вирусов и клеточные структуры
Метаболизм вируса осуществляется не в любой области клетки, а в определенных компартментах. Это означает, что имеются какие-то структуры, упорядочивающие процессы, которые осуществляются при развитии вируса. Электронно-микроскопические данные свидетельствуют о том, что вирионы «тяготеют» к некоторым клеточным элементам. В обзоре [33] говорится о ранних наблюдениях, из которых следует, что метаболизм вируса связан с определенными клеточными структурами. В настоящее время появилась возможность экспериментально изучать взаимодействия между вирусом и клеточным каркасом, и в этом разделе мы опишем первые результаты таких исследований. Они базируются главным образом на данных, полученных при избирательной экстракции, но имеется и несколько электронных микрофотографий, позволяющих получить хотя бы приближенное представление о таких взаимосвязях. ^
