Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Филдс Б.Н. -> "Вирусология: В 3-х т. Том 1 " -> 135

Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.

Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С. Вирусология: В 3-х т. Том 1 — М.: Мир, 1989. — 492 c.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка): virusologiyat11989.djvu
Предыдущая << 1 .. 129 130 131 132 133 134 < 135 > 136 137 138 139 140 141 .. 224 >> Следующая

Можно изучать биохимию структурных элементов с помощью фракционирования клеток, однако прогресс в этой области сдерживается отсутствием хороших морфологических маркеров. Главный недостаток электронной микроскопии состоит в том, что смолы, используемые при приготовлении тонких срезов, в значительной степени маскируют белковые структуры. Недавно попытались вновь использовать ранние методы электронной микроскопии без заливки [26, 38а]; в результате удалось с поразительной четкостью визуализировать трехмерную структуру кле-
1 Sheldon Penman, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts 02139.
точного белкового скелета, причем многие детали клеточной архитектуры были выявлены впервые. С помощью электронного микроскопа удается увидеть фиксированные и обработанные методом высушивания в критической точке интактные клетки [52]. Портер и др. показали, что сложная белковая сеть, которая видна в электронном микроскопе, состоит из обычных клеточных белков, в том числе и растворимых. Однако в полной мере возможности электронной микроскопии без заливки реализуются лишь при использовании избирательной экстракции, в результате которой удаляются растворимые белки [9, 32, 38, 45, 46, 48]. Оставшиеся скелетные структуры можно разделить на цитоскелет, хроматин и компоненты ядерного матрикса [15, 22, 37]. Далее можно исследовать морфологию и биохимию этих структур. На первый взгляд кажется удивительным, что электронная микроскопия объектов, помещенных в вакуум, обладает гораздо более высоким разрешением, чем электронная микроскопия объектов, залитых в смолы. Однако это объясняется чрезвычайной сложностью и переплетенностью клеточного скелета. Клеточный скелет — это свободно стоящая, самоподдерживающаяся структура. Такая структура должна быть видна в вакууме, если она по крайней мере на несколько нанометров возвышается над подложкой. Наиболее важные вирус-специфические белки и нуклеиновые кислоты часто можно обнаружить лишь в одной фракции, в комплексе с каким-либо структурным компонентом клетки; например, РНК полиовируса связана с цитоскелетом, а вири-он SV40 — с ядерным матриксом [3, 31].
Результаты применения этих новых процедур в вирусологических исследованиях весьма впечатляющи. С их помощью были обнаружены многие клеточные структуры, причем оказалось, что по крайней мере отчасти метаболизм всех вирусов животных предполагает использование структур цитоплазматического и ядерного скелета клеток. Действительно, вирус-специфический цитопатический эффект легко объяснить, предположив, что он обусловлен не бессмысленным для вируса повреждением клетки, а специфической перестройкой элементов клеточного скелета, цель которой — создание условий для роста вируса. Сейчас с помощью электронной микроскопии без заливки и биохимического фракционирования можно прямо изучать связь между метаболизмом вирусов и клеточной архитектурой.
До недавнего времени большое внимание в вирусологии уделялось изучению способов экспрессии уникальных информационных вирусных систем, т. е. «молекулярной биологии» животных и растительных вирусов; топографические же аспекты поведения вирусов оставались в стороне. Такие вопросы, как транспорт вирусных продуктов из одного клеточного компартмента в другой, сборка вируса и его созревание в определенных областях клетки,
а также удивительные специфические перестройки архитектуры клетки, относящиеся к понятию «цитопатический эффект», остаются пока малоизученными. Эти пробелы в наших знаниях объясняются не отсутствием интереса к данным вопросам, а недостатком концепций и экспериментальных подходов к решению таких проблем.
При приготовлении клеточных препаратов для электронной микроскопии (ЭМ) без заливки используются две методики. Самая простая из них — нанесение целого объекта, при которой клетки выращивают на золотой электронно-микроскопической сетке с напыленной углеродной пленкой-подложкой. Перед тем как поместить клетку под электронный микроскоп, производят экстрагирование до тех пор, пока на подложке не останется один цитоскелет или его субструктуры [45, 46]. Глубина резкости электронного микроскопа достаточно велика, и у сравнительно плоских клеток при умеренном увеличении можно увидеть весь клеточный «интерьер». Однако метод нанесения целого объекта обладает рядом недостатков; не самый последний из них — непривычный вид многих субклеточных элементов, изображения которых представляются в форме плоской проекции их трехмерных структур, а не в виде обычных двумерных поперечных срезов.
В результате развития техники без заливки смолой появился новый мощный метод, чрезвычайно полезный при изучении клеток, зараженных вирусом, — приготовление незалитого среза. В этом случае образец фиксируют, а затем пропитывают экстрагируемой «смолой» или воском [51]. Мы обнаружили, что для этой цели хорошо подходит диэтиленгликольдистеарат, но можно использовать также полиэтиленгликоль и метилакрилат [14]. Изображения, которые получают на этих срезах, очень сильно отличаются от обычных, поскольку даже на срезе толщиной 0,1 мкм имеется множество клеточных структур, которые оказываются полностью замаскированными при использовании обычной техники.
Предыдущая << 1 .. 129 130 131 132 133 134 < 135 > 136 137 138 139 140 141 .. 224 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed