Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Эш Б.Б. -> "Трансформированная клетка" -> 80

Трансформированная клетка - Эш Б.Б.

Эш Б.Б., Билл П.Т., Камерон И.Л. Трансформированная клетка — К.: Наукова думка, 1985. — 384 c.
Скачать (прямая ссылка): transformirovannayakletka1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 74 75 76 77 78 79 < 80 > 81 82 83 84 85 86 .. 211 >> Следующая

141
Рис. 5. Фракции клеток, остающихся в Gj-фазе, и фракции ДИК. не реплицируемой после добавления сыворотки к покоящимся клеткам. Индексы метки были получены после продолжительной обработки клеток Rati (ф) и Rati (RSV) (О) в среде ДМС, содержащей 20 % сыворотки и зн-1имидин (1 мк/Ки/мл). Разреженный монослой культур на покровных стеклах содержался в среде, лишенной эмбриональной сыворотки на 54 ч, для перевода клеток в покоящееся состояние. В это время оба типа клеток обладали микрофлюориметриче-скими профилями, характерными для Gj-фазы (см. рис. 1). С двухчасовым интервалом, начиная с 8 ч, культуры фиксировали и покрывали эмульсией (Kodak NTB-2). Авторадиограммы проявляли 7 дней спустя и процент немеченных клеток определяли на 1 ООО клеток в каждой точке. Процент нереплицируемой ДНК для клеток Rati (¦) и Rati (RSV) (Q) определяли, как описано прежде (Magun et al., 1979). Кратко, клетки метились 14С-гимидином за 2 дня до индукции в среде ДМС, лишенной эмбриональной сыворотки на 54 ч, при 39 °С. В это время {t = 0) среду в чашках заменяли свежей ДМС, содержащей 20 % эмбриональной сыворотки, 50 мкг/мл 5'-бромдезоксиуридина (Brdurd) и 0,1 мкг/мл 5'-флюоро-дезоксиуридина (FdUrd). Вновь реплицируемую ДНК определяли после центрифугирования ДИК, изолированной из культур при t = 10, 14, 18, 22, 26 и 30, в нейтральном градиенте хлористого цезия (CsCl) (незамещенная плотность ДНК-1,75 г/мл). Процент нереплицируемой ДНК определяли процентом ДНК, которая не достигала гибридной плотности, деленной на общее количество присутствующей ДНК.
радиоавтографически), скорость входа популяции в S-фазу значительно меньше, чем клеток Rati. Клетки Rati (RSV) начинали входить в S-фазу несколькими часами раньше клеток Rati. В параллельном эксперименте, показанном на том же рисунке, количество ДНК, реплицируемой полуконсервативно, определялось плотностью инкорпорированной метки во вновь созданную ДНК. Соответственно началу S-фазы, определяемой методом радиоавтографии, переход к постоянной скорости репликации ДНК наблюдался позже в клетках Rati по сравнению с.клетками Rati (RSV). К тому же конечная скорость репликации ДНК была ниже в трансформированных клетках. На рис. 4 продемонстрировано, что различия входа в S-фазу и ее прохождения поддерживались в течение 02-фазы и входа в последующие фазы клеточного цикла. Клетки Ratl(wt/RSV), для которых показаны начало входа в S-фазу и ее прохождение на 8 ч раньше по сравнению с клетками Rati, начинают делиться также примерно на 8 ч раньше. В дальнейшем скорость клеточного деления была больше в клетках Rati по сравнению с клетками Ratl(wt/RSV). Таким образом, различия вероятности входа в S-фазу сохраняются в следующем клеточном цикле.
Время после стимуляции, и
142
Рис. 4. Относительное увеличение числа клеток после стимуляции покоящихся клеток средой ДМС, содержащей 20 % эмбриональной сыворотки. Клетки Rati и Rati (RSV) рассаживали при плотности 1 X Ю1 клеток/см2 в 60-миллиметровые пластиковые чашки при 39 °С. Через 48 ч среду заменяли на ДМС без эмбриональной сыворотки. Через 54 ч = 0)т когда клетки достигали 01-ирофиля в проточном микро-флюориметрическом анализе (см. рис. 1), сроду заменяли на ДМС» содержащую 20 % эмбриональной сыворотки. С 2-часовыми интервалами три чашки клеток Rati и Rati (RSV) удалялп для измерения числа клеток после трипсиннаации в счетчике Coulter. С целью сравнения измеряемое число клеток нормализовали до их относительного числа.
Результаты, представленные на рис. 3, указывают на существование значительного промежутка времени между входом в S-фазу, определяемого с помощью радиоавтографии 3Н-тимидином, и синтеза Значительного количества ДНК. Например, через 14 ч после добавления сыворотки к покоящимся клеткам Rati (wt/RSV) 95 % ядер были мечеными, но только 20 % ДНК реплицировалось. Для тестирования возможного существования точки ограничения в ранней S-фазе в клетках Rati и Ratl(wt/RSV) были проведены следующие эксперименты. Клетки лишали сыворотки на 48 ч, в это время (t = 0) 8Н-тимидин добавляли в одиночный набор культур. В то же время метку плотности BrdUrd добавляли в парные наборы культур. Через 30 ч число меченых ядер подсчитывалось для первого комплекта, а количество полуконсервативно меченой ДНК определяли во втором комплекте (табл. 1). В клетках Rati метились только 5 % ядер, в то время как в культурах Ratl(RSV) 56 %. Однако если среда за-
Таблица 1. Индексы метки покоящихся клеток Rati и Rati (wt/RSV) через 30 ч после добавления 8Н-тимидина
Условия вкспериментв Истощенная среда без Свежая среда без сыворотки
сыворотки
Patl | Rati (wt/RSV) Rati | Rati (wt/RSV)
Меченые ядра к 30 ч, 5 56 66 73
% (1)
Реплицируемая ДНК 9 40 10 40
к 30 ч, % (2)
Примечание. Культуры клеток Rati и Rati (RSV)f некоторые из которых метили 14С-тимидином (2) при выращивании на покровных стеклах (1) или в пластиковых чашках диаметром 60 мм (2) в среде» содержащей 10 % сыворотки. При достижении разреженного монослоя среду заменяли на среду без сыворотки, в которой клетки оставляли W ч. В это время (t — 0) Ш-тимидин (1 мкКи/мл) добавляли к культурам на покровных стеклах (1) либо прямо в истощенную среду без сыворотки. Через 30 ч покровные стекла удаляла и подвергали радиоавтографии, как указано на рис. 3. К клеткам, меченным 14С-тимиди-ном (2), при *=. 0 добавляли BrdUrd нак метку плотности (см, рис. 3) либо прямо в истощенную среду без сыворотки, либо в свежую среду без сыворотки. Через 30 ч клетки собирали и процент реплицируемой ДНК определяли в градиенте плотности CsCl, как показано на рис, Э.
Предыдущая << 1 .. 74 75 76 77 78 79 < 80 > 81 82 83 84 85 86 .. 211 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed