Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
43
2.5.3.2. Артефакты агглютинации
Агглютинация лектинами является флокулирующим процессом, при котором многоклеточные агрегаты сформированы в результате перекрестного связывания лектином. Процесс начинается, когда две единичные клетки становятся перекрестно связанными в форме клеточной пары или дублета. Начальная скорость агглютинации в хорошо перемешанной однородной суспензии — функция первоначальной концентрации частиц, скорости перемешивания, размера, формы и плотности индивидуальных клеток и присущей их поверхностям агглютинабельиости. В то время как агглютинация происходит, природа процесса изменяется фундаментально. Развивается целая серия эффектов второго порядка, которые ничего не имеют общего с присущей агглютинабельностью per se, но которые могут глубоко повлиять на самые ранние фазы агглютинационного процесса.
Если однажды клеточные дублеты сформировались в агглютинирующей суспензии, в дальнейшем агглютинация будет результатом не только формирования пар при столкновении синглетов, но также результатом формирования больших агрегатов, таких, как триплеты и квадриплеты. В то время как большие агрегаты сформированы, тотальная концентрация частиц будет уменьшаться, тогда как размер агрегатов и перекрестное столкновение будут увеличиваться. Постепенно формируется многодисперсный коллоид, который содержит агрегаты различных размеров, колеблющихся от единичных клеток до агрегатов, содержащих миллионы клеток. В течение начальных стадий агглютинации многоклеточные агрегаты будут формироваться почти исключительно за счет дублетов. В этих условиях либо исчезновение синглетов, либо появление многоклеточных (преимущественно) дублетов обеспечивает точный индекс агглютинационного процесса. После начальной стадии этого процесса вклад синглетов прогрессивно уменьшается, а агрегатов — увеличивается. Концентрация синглетов заметно не изменяется, в то время как агглютинация развивается, и число агрегатов может действительно уменьшаться. К примеру, два кластера из 10 клеток сливаются, чтобы сформировать один кластер из 20 клеток. При этих условиях исчезновение синглетов несущественно для измерения степени агглютинации, в то время как число многоклеточных агрегатов в действительности не отражает истинного агглютинационного процесса.
Единичные индивидуальные клетки в суспензии умеренно однородны по размерам, форме и массе. Гантелевидной формы дублеты составляют субпопуляцию также умеренно однородную. Сверх дуп-летного размера, однако, эта однородность утрачивается. Клеточные триплеты, например, могут геометрически располагаться в двух различных конфигурациях: конец в конец в цепи из трех клеток в ряд или треугольным порядком. Большие агрегаты из нескольких дюжин клеток могут принимать сбивающий с толку ряд геометрических конфигураций. Более того, клетки в таком агрегате могут быть либо свободно, либо тесно упакованы. Общая геометрия любого наименьшего агрегата гипервариабельна: с чрезвычайно беспорядочными
44
пучками, цепями, сфероидами и петлями — все перемешано. Таким образом, два агрегата с идентичным числом клеток будут обычно существенно отличаться по форме, поверхностной области, по поверхностной неровности, сечению перекрестного столкновения, центру ротации, ротационной скорости в перемешиваемой среде и способности пассивного отделения или высвобождения других клеток или агрегатов неагглютинационньш механизмом. Различия степени проявления этих параметров вторичного порядка в свою очередь подтверждают широкую вариабельность скорости движения агрегатов в сосуде для перемешивания. Изменения в любой из этих характеристик будут нарушать кинетику агглютинации таким способом, что затмевают истинную агглютинабельность клеточной поверхности.
В многодисперсных коллоидах агрегаты широко различаются своими характеристиками, а классы агрегатов различного размера обычно отделяются один от другого пространственно. Таким образом, не только общая концентрация частиц широко варьирует в различных частях сосуда, но подобным образом изменяются частота появления и размер различных классов агрегатов, так же как локальная скорость агрегации или агглютинации. Измерения агглютинации в слабо различающихся по значениям местах сосуда для перемешивания могут, следовательно, дать фундаментально различные картины скорости и степени агглютинационного процесса (Skehan, Friedman, 1975; Wright et al., 1977). Когда два различных типа клеток сравнивались по их способности агглютинировать или агрегировать, небольшие различия в их размере и форме, плотности или предпочитаемой геометрии агрегации могут создавать громадные различия соответственно в их скорости и степени агглютинации, которая не имеет ничего общего с присущей агглютинабельностью и которая полностью опосредована вторичными эффектами. Эти артефакты являются основным источником ошибки в сравнительных исследованиях агглютинации лектином.
Агглютинабельность лектином может быть точно замерена только тремя путями. Первый — измерение начальной скорости агглютинационного процесса в условиях, когда могут существовать только синглеты и дублеты. Этот метод идентичен таковому для начальных измерений скорости в кинетике энзимов; в самом начале процесса реакции концентрация реактивов (синглетов) и продуктов (дублетов) приблизительно постоянна, а вторичные эффекты незначительны. К сожалению, использование метода начальной скорости является редким при исследовании агглютинации (Маса, Ноак, 1974; Vlo-davsky, Sachs, 1975; Linnemans et al., 1976). Второй метод, который уместен только при обстоятельствах, где вторичные эффекты достаточно малы, чтобы ими пренебречь,— определение уровня равновесия агглютинации, при котором агрегационные и диссоциирующие силы сбалансированы, а степень агглютинации достигла неизменяемого уровня плато. Этот метод использовался весьма редко. В общем, или плотность клеток была слишком высокой, чтобы можно было избежать вторичных эффектов (Burger, Goldberg, 1967; Furmanski et al., 1972; Oppenheimer, Odencrantz, 1972; Deman,
