Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
(1)
10.2.2.2. Параметры трансляционной диффузии
21*
307
в этой дисперсии продолжается. Как и раньше, молекулы продолжают перемещаться относительно друг друга. Предлагаемый здесь метод спиновых меток служит для определения диффузии в такого рода дисперсиях. Определенной концентрации спин-меченые молекулы в определенной жидкой среде будут с определенной частотой сталкиваться друг с другом. В разбавленных растворах почти все такого рода столкновения спин-меченых молекул будут биомолеку-лярными. Частота столкновений Ct среди спин-меченых молекул ограничивается концентрацией этих молекул вязкостью растворителя г[ и температурой раствора. В изотропной среде удвоение величины Msl должно приводить к двукратному увеличению частоты столкновений. В изотропной среде при постоянной температуре отношение CjIMbl должно иметь постоянное значение. Отсюда уравнение для определения диффузии D с помощью параметров спин-меток будет иметь следующий вид:
где К — константа пропорциональности, равная 2 X 10-14 (Keith et al., 1977в). Частота столкновений Cf определяется по зависимому от концентрации уширению линии АН
так как только столкновения между молекулами с противоположными спинами приводят к уширению линии. Обычно величина Z?sl вычисляется из уравнения
Значения ДН показывают изменение ширины линии вследствие спин-спинового взаимодействия меток и определяется по формуле
где АНм — ширина линии данной молярной концентрации; АНт1п — минимальная ширина линии очень разбавленных спин-меток (10”5 М и менее), а АН — ширина линии, отражающая концентрацию спин-метки. В изотропной среде полученные значения D$ь хорошо соответствуют размеру диффузии Z>, определенной классическими методами. В гетерогенной среде, где могут существовать барьеры для продольного передвижения молекул, значения Z?sl ий не согласуются.
При необходимости получить значения тс и Z?sl это можно сделать на одном и том же спектре и в одно и то же время. В изотропной среде отношение AsiAc должно иметь одинаковое постоянное значение. В анизотропной среде возможно снижение этого отношения. DSb определяется силами межмолекулярных взаимодействий, оперирующими на расстоянии, немного большем, чем диаметр вращающейся сферической молекулы растворенного вещества. Их значения
(4)
С, = 2ДЯ,
(5)
ДЯ = ДЯМ - ДЯт1п,
(7)
10.2.2.3. Одновременное измерение те и Dsl
308
могут быть приблизительно вычислены из уравнения пространства кубической решетки
о (1027 h/N)y>
“ (?т)Чш '
где N — число Авогадро, а — молярная концентрация спин-меченых молекул. В гетерогенной среде, в которой существуют препятствия для диффузии, значение Dsl может быть много меньше расчетного. Так же, как при взаимодействии меток между собой, происходит обмен спинов, сопровождающийся уширением линии АН, при взаимодействии спин-меток с парамагнитными молекулами отмечается уширение линии, которое вносит свой вклад в общий сигнал спин-метки. С помощью не проникающих в клетку парамагнитные молекул, таких, как ионы Ni2+, можно разделить сигналы спин-меток,, располагающихся вне и внутри клетки. Это позволило использовать ионы Ni2+ в необходимом количестве, обычно изотонические или более низкие концентрации, в суспензии клеток культуры. При этом уширение линии первой производной сигнала происходит также в результате уменьшения его амплитуды, так как амплитуда сигнала обратно пропорциональна площади ширины линии. Оказалось^ что 50—100 мМ Ni2+ обычно более чем достаточно для определения внеклеточного сигнала. Все описанные выше теоретические предпосылки были использованы в настоящем исследовании. Несомненно, Ni2+ отнюдь не только парамагнитная молекула, но и молекула, отвечающая требованиям агента^ уширяющего линию внеклеточного сигнала.
10.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 10.3.1* Подвижность спин-меток в модельных системах
Так как цитоплазма представляет собой совокупность органелл и молекул различных размеров, представлялось целесообразным смоделировать некоторые отдельпые компоненты цитоплазмы путем приготовления различных водных растворов. Необходимо было продемонстрировать наглядность анализа параметров растворенного вещества (с помощью исследования подвижности спин-метки в растворах), таких, как размер молекул, их форма, концентрация и поверхностные свойства. В соответствии с поставленными задачами мы обсудим только некоторые из них. Такого рода параметры могли быть продемонстрированы путем исследования поведения спин-меток в концентрированных растворах сахарозы и в полиакриламидном геле. Одни молекулы (сахароза) — небольшие, хорошо растворимые в воде молекулы, другие, например полиакриламида,— линейные полимеры, образующие гель при комнатной температуре. Анализ молекулярной подвижности в этих двух средах оказался не таким простым* как казался на первый взгляд. В растворах сахарозы до 70 %-ной концентрации это можно было сделать легко. Приготовить растворы более высокой концентрации и тотчас же измерять в них молекуляр-
