Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
21 5-1329
305
Й»
Рил. В. Влияние NiCla на рост клвтон ЗТЗ. Клетка была посажены в числе 5 х 10* ва
, ооо 60-миллиметровую чашку в модифициро-
Ю - о * * § ванной Дюльбекко среде Игла с 10 % эм-
ft
0 I 9 в ¦ брионвльной сывороткой теленка. Затем t через сутки среду убрали, а клетки дважды
промыли в 0,9 % NaCl. Один ил 100 мМ
fa J ЦрОМЦЛИ В vj v д) v/ДНп MJ1 1 vv MIYI
р » ° NiCl2 или 0,9 % NaCl был добавлен на
0 10 мин в чашки с отмытыми клетками. По-
^ • том клетки снова дважды отмывались
^ Ю51-» 0,9 % NaCl, в чашки добавляли среду и по-
§ l° мещали в термостат ори температуре 37°С.
§ ? В третьем варианте эксперимента клетки
§ f оставались интактными. В течение 7 сут,
через 12 ч подсчитывали число клеток в дублирующих культурах. Культура до-, стигала состояния насыщения при 3—4 X
№ ------1---1 1 ¦ * » ¦ X 10 клет©к/см2 (•) 100 мМ NiC.l2;
0 1 2 3 4 5 6 7 (О) 0,9% NaCl; (¦) интактные клетки. По
Время сутки оси ординат — числе клеток в культуре,
по оси абсцисс — время (сутки).
Приблизительно 40 мкл среды остается в каждом осадке. Клетки нежно встряхивали и спин-метку, NiCl2 и НаО быстро добавляли к этому образцу. Приготовленную суспензию клеток втягивали в 100-микро-литровую капиллярную стеклянную пипетку. Конец пипетки, противоположный клеткам, быстро запаивали в пламени, охлаждали, а затем центрифугировали (ротор № 5 на клинической центрифуге IEC) в течение 1 мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость отсасывали тонкой капиллярной пипеткой, а образец размещали в резонаторе ЭПР-спектрометра для анализа. Приблизительно 6 мин проходит от добавления спин-метки и NiCl2 до конца записи сигнала. Спин-метки, используемые в этих исследованиях, были PCAOL или TEMPONE (их структура показана на рис. 1).
Длительная экспозиция клеток с NiCl2 может быть токсичной. В связи с этим было проверено действие NiCla в течение короткого времени на рост и жизнеспособность клеток. Спустя 24 ч после пересадки клеток в DMEM и 100 % сыворотки ЗТЗ-клетки были обработаны 100 мМ ШС12илиО,9 % NaCl в течение 10 мин. Клетки отмывали 0,9 % NaCl и проверяли их жизнеспособность в тесте на реакцию трипановым синим. Больше чем 99 % клеток после инкубации в течение 10—30 мин с NiCl2 не окрашивались трипановым синим.
Эксперименты по изучению влияния на рост NiCl2 проводили следующим образом. Свежую среду с 10 % сыворотки добавляли снова к обработанным NiCla клеткам, которые выдерживали в термостате при температуре 37 °С в течение недели. В качестве контроля служили клетки, к которым добавляли 0,9 % NaCl, а также интактные клетки. По мере роста культуру обрабатывали трипсином и подсчитывали число клеток.
Скорость роста клеток во всех трех случаях была одинакова (рис. 2). В этих экспериментах плотность насыщения приблизительно 3 X 104 клеток/см2 достигалась на 3-е сутки. Аналогичные результаты были получены при изучении влияния NiCl2 на клетки ВНК.
306
10.2.2. Измеряемые параметры
10.2.2.1. Время вращательной корреляции
Время вращательной корреляции (тс) используется в качестве параметра, одределяющего свободу вращательной подвижности спин-метки. Определяемый параметр тс дает незначительные отличия в числовых значениях для различных спин-меток, обусловленных свойственными им факторами. Эти отличия не представляют серьезной проблемы и в практике одни и те же спин-метки используются в сравнительных экспериментах. Величина тс определяется по формуле
где W0 — ширина первой производной средней линии; Л0 и h—\ — амплитуды средне- и высокопольной первой производной спектра поглощения; 6,5 X 10“10 — постоянная числовой пропорциональности, полученная с помощью общей обработки Кивелсона (Kivelson, 1960). Общие ограничения, которые накладываются на показатели тс, вытекают из уравнения Стокса — Эйнштейна, приведенного ниже:
Оно указывает, что объем (молекулярной формой пренебрегаем, так как в представленных спин-метках она близка к сферической) вращающейся молекулы, которая преодолевает вязкость г\ при температуре Г, выраженной в К, определяет значение тс. Это должно указывать на то, что значения тс снижаются благодаря молекулярным силам, которые действуют на относительно коротких расстояниях от поверхности вращающейся молекулы.
Общую диффузию D можно определить различными способами, например уравнением общей диффузии Стокса —
где к — постоянная Больцмана.
Это уравнение отражает движение молекул в среде. Константа диффузии D, вычисленная по приведенному выше или другому способу определения, связана со скоростью движения фронта молекул. Фронт движения молекул определяется размером градиента концентрации dCIdX. Градиент концентрации образуется вследствие того, что концентрация представляющего интерес растворенного вещества С уменьшается на протяжении некоторого линейного промежутка времени X. Эта локальная концентрация растворенного вещества будет диффундировать до тех пор, пока не образуется равномерная дисперсия. После образования равномерной дисперсии большинство методов измерения диффузии не могут ее зарегистрировать, хоть диффузия
