Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
303
равличных интервалов времени в пределах (от минут до суток), зависящих от типа клеток и структуры спин-метки.
Параметр спинового обмена определяется частотой столкновений спин-меток. Используется он для измерения трансляционной диффузии. При одинаковой концентрации частота столкновения спин-меток зависит от вязкости микроокружения.
В действительности спектр сигналов спин-метки отражает поглощение ею микроволновой энергии. Резонансные условия, в которых происходит это поглощение, достигаются путем размещения образца, содержащего спин-метки в резонаторе ЭПР-спектрометра, где через образец под прямым углом друг к другу проходят магнитное поле и микроволновое облучение. Когда частота микроволновой энергии и магнитное поле Н достигают значений собственной энергии, наступает поглощение и сигнал может быть зарегистрирован. При обработке спектров учитываются амплитуда сигнала, ширина линии, расстояние между линиями. С помощью точного измерения амплитуды и ширины линии может быть вычислен показатель тс. Показатели, связанные с трансляционной диффузией, могут быть вычислены по данным ширины линии спектра. Все эти параметры описаны более полно в представленных подразделах.
Связанные с применением спин-меток методы позволяют получать информацию как о вращательном, так и о трансляционном передвижении молекул. Вращательная подвижность оценивается временем вращательной корреляции тс и прямо вычисляется по параметрам спектров. Широкое обсуждение этого показателя представлено в литературе и в общем оценивается как надежная величина (Kivel-son, 1960). Трансляционная диффузия определяется по параметру спинового обмена. В литературе хорошо разработана теория трансляционной диффузии (Kivelson, Collins, 1962; Freed, 1966; Miller et al., 1966; Plachy, Kivelson, 1967; Eastman et al., 1970; Anisimov et al., 1971; Salikov et al., 1971), в частности использование спин-меток для измерения двухмерной диффузии в мембранах (Sackmann, Trauble, 1972а, b; Trauble, Sackmann, 1972; Devaux et al., 1973; De-vaux, McConnell, 1972; Barnett, Grisham, 1972; Scandella et al., 1972) и в водной среде (Keith et alM 1977a, b).
Спин-метки широко применяются при исследовании структуры изолированных белков и мембран. С помощью гидрофобных спин-меток широко изучали модельные липидные мембраны, многослойные фосфолипидные пленки и выделенные из клеток фракции мембран; менее широко — мембраны интактных клеток. Использование гидрофильных спиновых меток в качестве зондов для изучения свойств водной фазы клеточной цитоплазмы начато позднее и продолжается до настоящего времени (Keith, Snipes, 1974; Morse et al., 1975; Henry et al., 1976; Hammerstedt et al., 1976, 1978).
Объектом для изучения биологических систем с применением спин-меток были главным образом модельные мембраны, а также биологические мембраны и белки. Исследования мембран были сконцентрированы на изучении их молекулярной организации, общих представлений о «текучести» мембран и фазовых перестроек или фа-
304
зового разделения различных областей в мембранах. Целью исследования белков с помощью спин-меток было изучение тонких структурных особенностей молекул белков. Успех исследований мембран и белков основан на расположении соответствующих спин-меток в определенных местах. НапримерЛ гидрофобные зоны мембран, граница между углеводородной и водной фазой* полярная зона мембран или водная фаза вблизи поверхности мембран — все это места* которые могут быть избирательно изучены с помощью спин-зондов. Эти исследования направлены на получение полезной информации о таких свойствах мембран, как локальные полярность, препятствия вращательному движению, температура, при которой происходит изменение фазового состояния компонентов мембран и другие производные параметры* относящиеся к физическим свойствам мембран.
10.2. МЕТОДЫ 10.2.1. Клетки
10,2.1.1. Культура
В большинстве экспериментов использовались клетки почек новорожденных хомячков (ВНК) Swiss ЗТЗ и трансформированные SV40 клетки Swiss ЗТЗ. В некоторых экспериментах мы также исполь-аовали клетки BALB/c ЗТЗ и трансформированные SV40 клетки ЗТЗ, полученные от доктора Paula Beall (Baylor College of Medicine) и BALB/c 3T3, SV40 ЗТЗ и трансформированные метилхолантреном 3T3A полученные от доктора Robert Scott (University of Minnesota). Клетки для пересадки брали при низкой плотности клеток в модифицированной Дюльбекко среде Игла (DMEM) со стрептомицином (10 мг/мл) и пенициллином (100 единиц/мл), также с 10 % сыворотки теленка или 10 % эмбриональной бычьей сыворотки и культивировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % С02. ВНК и SV40 ЗТЗ-клетки метили в экспоненциальной фазе роста. Клетки ЗТЗ были использованы также в качестве покоящейся культуры или синхронизированной в О^фазе, как это было сделано в отдельных экспериментах.
10.2.1.2. Введение спин-меток
Все последующие операции выполняли при комнатной температуре. Из чашек для культивирования диаметром 100 мм с приготовленными для введения спин-меток клетками удаляли 1—2 мл среды. Клетки собирали с поверхности чашек резиновым силиконированным валиком (скрепером) и взвешивали в оставшейся среде. Взвесь клеток из нескольких чашек собирали и центрифугировали (300 g, б мин). Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в кондиционированной среде до концентрации 3—10 X 10е клеток/мл. Один миллиметр полученной взвеси клеток отбирали пипеткой и переносили в стеклянную пробирку размером 12 X 75 мм, цент-рифугировали* а надосадочную жидкость осторожно удаляли.
