Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В противоположность обширной информации о влиянии цитоплазматических структур на воду меньше известно о движении растворов в цитоплазме клеток. Возможно, роль клеточной надструктуры, а также содержания и организации связанной воды заключается в облегчении диффузии и локальных взаимодействий ионов и небольших молекул. С такой точки зрения цитоплазма клеток совершенно не изучена.
Представленный метод измерения трансляционной подвижности (D) с помощью спин-меток отличается от методов измерений классической или обычной диффузии.
Полученные методами, измеряющими обычную диффузию, результаты захватывают широкий диапазон значений, например, они покажут, что агаровый гель твердый. С помощью метода, основанного на использовании спин-меток, мы установили, что водная фаза в агаровом геле такая же текучая, как в равном объеме воды. Этот метод позволяет измерять диффузию в диапазоне от 20 ангстрем до нескольких сотен ангстрем и не зависит от текучести общей массы. С помощью ЯМР, в принципе, также можно измерять диффузию в сверхмикродиапазонах, но этот метод значительно менее чувствителен по сравнению с методом спин-меток. Описанные здесь исследования, проведенные с помощью спин-метки, дают косвенную информацию о клеточной воде. Так как спин-метки располагаются в водной фазе цитоплазмы, регистрируемое движение спин-меток ограничивается в связи с физическим состоянием воды. Спин-метки растворяются, а движение их молекул ограничивается вследствие следующих взаимодействий: раствор — раствор, раствор — клеточные структуры.
Электронный парамагнитный резонанс ЭПР), часто называемый в биологической литературе как электронный спиновый резонанс, позволяет определять наличие или свойства атомов или молекул, содержащих, по крайней мере, один неспаренный электрон. В некоторых обзорах, опубликованных в течение нескольких последних лет, описывается использование этой техники для исследования мембран и белков (Berliner, 1976). Использование спин-меток для изучения свойств цитоплазмы до некоторой степени ново (Keith, Snipes, 1974; Keith et al., 1977 a, b).
ЭПР — чувствительный метод, позволяющий измерять парамагнитные молекулы, называемые спин-метками, причем такие их низкие концентрации, как 10—'7 М. Аналогичных сигналов, накладывающихся на сигнал спин-меток, в естественных биологических образцах не существует. С помощью относительно простых химических методик был синтезирован широкий набор различных спин-меток (Berliner^
302
Рис. 1. Структура двух спин-меток. Показаны А
структурные формулы двух спин-меток, используемых в настоящем исследовании:
TEMPONE — 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил; PCAOL-2,2,5,5 тетраметил-3-кар- теиЬпи'? боксшшрролин-]Ч-оксил. ' %
1976), таким образом, доступность спин-меток не ограничивает возможности экспериментов. * О
На рис. 1 показаны две спин-метки, используемые в настоящем исследовании, которые представлены в качестве примера структуры спин-меток. Основ- pc/\QL ная характеристика структуры спин-меток — высокоэкранированный окисленный атом азота (группы N0). Эта структурная конфигурация стабильного свободного радикала парамагнитна.
Природа сигнала ЭПР позволяет измерять несколько параметров, которые дают информацию о физических свойствах и микроокружении спин-меток. Спин-метки могут быть размещены на различных органических молекулах в пределах от небольших молекул до белков, углеводов, полинуклеотидов. Различия спектров ЭПР спин-меток зависят от влияния на них микроокружения. Одним из наиболее распространенных параметров ЭПР является постоянная сверхтонкого взаимодействия, позволяющая регистрировать изменения полярности среды выше на несколько десятых нанометра от поверхности спин-метки. Этот параметр определяется измерением магнитного поля между низкими и средними резонансными его линиями, выраженного в Гс. Типичные значения 16,3 Гс для TEMPONE в воде и 14,5 Гс для TEMPONE в гексане. Спин-метки, растворимые в углеводородах, будут давать значения An, типичные для углеводородных растворителей в водно-масляных эмульсиях.
Вращательная подвижность спин-меток определяется производным параметром — временем вращательной корреляции (тс), широко используемым для измерений вязкости среды окружения метки. Оно характеризует сумму всех ограничений вращательного движения метки* Для сферических молекул с одинаковым обменом и массой распределение осей вращения является случайным. Такой тип вращательного движения называется изотропным. Молекулы, не имеющие сферической симметрии, вращаются вокруг одной или нескольких определенных осей. Такой тип вращательного движения называют анизотропным.
В дополнение к данным о полярности вязкости среды, окружающей спин-метки, их вращательной подвижности у экспериментаторов имеется также возможность измерять скорость исчезновения сигнала вследствие присоединения атома водорода к нитроксильной группе спин-метки. Клетки различных организмов, в том числе и млеко-пит ающихА могут вызывать исчезновение сигнала на протяжении
