Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 90

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 130 >> Следующая

При помощи схем 1—6 (рис. 48) опишем последовательность операций при использовании зонального ротора. На схемах 1—3 изображено образование градиента плотности среды для центрифугирования, например раствора сахарозы. Через систему каналов к периферии ротора насосом (ступенчато или плавно) подают сначала менее плотную, а затем более плотную жидкость. Последняя оттесняет первую от наружной стенки в глубь ротора. Когда весь расчетный объем градиента (обычно 60— 70% полного объема ротора) войдет в ротор, подкачку наиболее плотной жидкости продолжают до тех пор, пока жидкость не появится в трубке центрального канала. Таким образом из ротора полностью удаляется воздух, чему способствует и коническая форма центрального стержня крестовины.
На схеме 4 показан этап внесения препарата. Его накачивают насосом или подают из шприца через центральный канал, в то время как лишний объем «подушки» вытекает обратно через периферийную систему каналов. Для хорошего разделения объем препарата не должен превышать 10% объема полости ротора. Подавать его следует медленно и плавно. Для улучшения фракционирования целесообразно вносить препарат также в растворе сахарозы небольшой плотности, а затем на него наслаивать буфер (около 7% объема ротора). Таким образом препарат оттесняют от конического стержня крестовины, и он образует ровный цилиндрический слой, лежащий на градиенте.
На схеме 5 показан конечный момент зонально-скоростного центрифугирования. Ротор закрыт пробкой и вращается с большой скоростью. Частицы распределились вдоль градиента в соответствии с их константами седиментации.
Наконец, на схеме 6 изображена ситуация в момент сбора и фракционирования градиента. Вновь на малой скорости через переходное устройство на периферию ротора подается жидкость, более плотная, чем та, что входит в состав градиента, например 60%-ный раствор сахарозы. Градиент последовательно, от менее плотной до более плотной его части, вытекает через центральный канал. Выносимые им частицы регистрируются
Рис. 49. Крестовина и конусное кольцо (тип В-29) (см. текст)
денситометром, флюориметром и (в проточной кювете) счетчиком радиоактивности и далее попадают в коллектор фракций.
В некоторых случаях сбор градиента удобнее начинать с более плотной части, т. е. с периферических слоев жидкости в роторе. Такая ситуация возникает, например, в том случае, когда нужные частицы располагаются близко к концу градиента. Иногда фракционирование ведут в два этапа. На первом этапе, когда быстро оседающие частицы подходят к концу градиента, рабочее центрифугирование прерывают и на малой скорости вытесняют конец градиента вместе с этими частицами через периферическую систему каналов наружу. Затем через эту же систему подкачивают плотную «подушку» и отодвигают оставшуюся часть градиента от стенки ротора. На втором этапе фракционирования ротор вновь разгоняют до рабочей скорости вращения и производят разделение медленно оседающих частиц обычным способом.
Для вытеснения жидкости через периферическую систему каналов буфер или воду подкачивают через центральный канал, однако в зональном роторе с обычной крестовиной зоны градиента оказываются смазанными. Удобнее для тех же стандартных разборных роторов пользоваться специальной крестовиной (тип В-29) и дополнительным кольцом, придающим наружной стенке полости ротора форму перевернутого конуса (рис. 49). В этой системе зоны градиента, не искажаясь, одна за другой выходят через периферическую систему, каналы которой связаны с верхним «углом» конической полости ротора.
Фирма «Beckman» выпускает пять модификаций роторов описанного типа. Роторы Ti-14 и А1-14 отличаются друг от друга материалом, из которого они изготовлены, и соответственно максимально допустимыми скоростями вращения: 48 и 35 тыс. об/мин. Вместимость обоих роторов 665 мл. Два других одинаковых по конструкции зональных ротора (Ti-15 и А1-15) вмещают по 1675 мл и могут работать при скоростях вращения 32 и 22 тыс. об/мин соответственно. Высокоскоростной 'титановый ротор Z-60 объемом 330 мл может работать на скорости 60 тыс. об/мин. Он имеет определенные конструктивные отличия от названных выше роторов, но в принципе сходен с ними и применяется с тем же самым переходником.
Заполнение зонального ротора при открытой камере центрифуги занимает немало времени (около 1 ч). Если работают с охлаждением, то при этом происходит столь значительное накопление конденсата на стенках камеры, что для достижения вакуума, необходимого для разгона ротора до высокой скорости, воздух из камеры приходится откачивать в течение нескольких часов. При этом весь конденсат попадает в масло форва-куумнош насоса. Было предложено в этом случае закрывать камеру легкой крышкой из плексигласа с уплотнениями для ввода трубок. Крышку можно прижать к уплотнительной прокладке, откачивая воздух из камеры водоструйным насосом [Webb, Clark, 1976].
Ультрацентрифуги фирмы «Beckman» снабжают еще и проточным ротором типа CF-32Ti, допускающим частоту вращения до 32 тыс. об/мин. Его используют обычно для сбора вирусов из большого объема лизатов. Операции такого рода им«еют лишь косвенное отношение к исследованию белков и нуклеиновых кислот, поэтому конструкция проточного ротора здесь не рассмотрена.
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed