Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, напротив, находятся в водной фазе и под действием электрического поля мигрируют в направлении катода. Их место занимают катионы, поступающие из анодного буфера. Возникает дополнительный ток сильно гидратированных катионов, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней — растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Они «дрейфуют» вместе с жидкостью, и это движение накладывается на их миграцию под действием электрического поля.
В большинстве случаев электрофорезом в агарозе разделяют отрицательно заряженные макромолекулы, мигрирующие к аноду. Эндосмос направлен в противоположную сторону и ухуд-
Рис. 4, Влияние эндосмоса в агарозном геле н\d характер фракционирования двунитевых ДНК одинакового размера [Johnson et al„ 1980]
l — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — крльцевая; степень эндосмоса увеличивается слева направо
шает разделение. Ввиду этого агарозу подвергают специальной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0,5%. Типы агарозы, отличающиеся слабо выраженным эндосмосом, содержат менее 0,3% сульфата. В случае необходимости можно провести дополнительную очистку агарозы от сульфата обработкой 1 М NaOH в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаж-дением 50%-ным этанолом (Lonnerdal, Laas, 1976].
Насколько существенно эндосмос может влиять на результаты электрофореза, видно из даннь/х Джонсона и др. [Johnson et al., 1980]. Авторы использовали три типа агарозы с различной способностью к эндосмосу (значения — тг составляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441; см. ниже). В одном и том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК фага ФХ 174-сверхскрученной, кольцевой и линейной. С усилением эндосмоса не только происходило сильное замедление скорости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже) менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому, различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-разному.
Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результате чего полосы расплываются с образованием «хвостов».
Степень эндосмоса количественно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции (—тТ). Знак «минус» здесь только напоминает о том, что за счет эндосмоса нуклеиновые кислоты «сносит» в сторону, противоположную направлению их миграции. Коэффициент представляет собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) и сходного с ним по структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа. Для обозначения типов агарозы ниже будет использована номенклатура фирмы «Miles». По данным каталогов, в частности по значениям — тг, ее нетрудно сопоставить с обозначениями других фирм, тем более что большинство из них получает свои препараты от одного- и того же производителя — фирмы «Marine Colloids Inc.».
Для агарозы с малой степенью эндосмоса (тип LE) —mr = =0,14-0,15. Для агарозы типа НЕ характерен сильно выраженный эндосмос (—mr=0,23-^0,26). Агароза типа ME занимает промежуточное положение (—mr = 0,15-г-0,2). Чем меньше в ага-
розе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростатического угталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Агароза с повышенными температурами плавления и гелеобразования (тип HGT) имеет —тг<0,1; именно она чаще всего используется для обычного электрофореза. Вместе с тем специальная технологическая обработка (введение оксиэтильных групп) позволяет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженными температурами плавления и затвердевания — тип LGT («Sea plaque» по номенклатуре фирмы «Marine Colloids»). Такая агароза может быть полезна тем, что ее 1%-ный раствор остается жидким при физиологической температуре (37°); кроме того, плавление геля можно осуществить при температуре более низкой, чем температура денатурации ДНК. Наконец, для иммуноэлектрофореза, при котором иммуноглобулины мигрируют к катоду и эндосмос способствует, а не препятствует их разделению, была разработана специальная агароза типа НЕЕО с сильно выраженным эндосмосом (—mr>0,3). Этого удалось добиться не за счет увеличения числа сульфатов, содержание которых по-прежнему не превышает 0,3%, поэтому неспецифическая сорбция белков на агарозе этого типа почти не происходит.
Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-филизированного порошка. Для приготовления геля выбр-анной концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термостате при 90—95° около 2 ч для образования истинного раствора полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обратным холодильником.
Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смешивают с раствором агарозы в горячем виде (при 50—60°). Они не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водородные связи, несколько затрудняет образование геля. Например, гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при 75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980].
