Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Электрофоретическая элюция
Большой отрицательный заряд нуклеиновых кислот открывает широкие возможности для их электрофоретической элюции из ПААГ и гелей агарозы. Предложено много вариантов соответствующих устройств. В подавляющем большинстве из них нуклеиновые кислоты элюируют в диализный мешочек или в камеру, отделенную от анодного резервуара диализной мембраной. Однако нуклеиновые кислоты хорошо сорбируются на диализной пленке, и без принятия специальных мер их потери могут быть значительными. В числе таких мер можно назвать реверсию направления тока на короткое время перед опорожнением мешочка, внесение балластной (немеченной) нуклеиновой кислоты, когда это допустимо, и, наконец, предварительную обработку диализной пленки с целью уменьшения ее сорбционной способности. Для этого, помимо обычного кипячения в 5%-ном растворе NaHCOa, промывки водой и кипячения в 5 мМ растворе ЭДТА, диализные мешочки рекомендуется вымачивать в течение 12 ч на холоду в уксусном ангидриде и затем хорошо промывать водой [Perlman, Huberman, 1977]. Сорбционную способность диализной пленки иногда насыщают предварительной промывкой раствором бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и даже вводят БСА в буфер, заполняющий диализный мешочек [Klessig, Grodzicker, 1979]. Однако с этим связана необходимость последующего отделения элюированной ДНК от белка.
В конструктивном отношении устройства для электрофоретической элюции выполняются как с вертикальным, так и с горизонтальным расположением геля. Простейший из вариантов с вертикальным расположением представляет собой обрезанную сверху пластиковую пипетку на 10 мл с диализным мешочком на конце. В пипетку помещают пробку из стекловолокна, на которую и выдавливают из шприца измельченный гель. Пипетку заполняют буфером и с помощью U-образной трубки соединяют с катодным резервуаром [Galibert et al., 1974].
В препаративном варианте для электроэлюции однонитевых рестриктов ДНК из геля агарозы его можно расплавлять и повторно заливать в трубку, на конец которой следует затем надеть заполненный буфером диализный мешочек. Элюцию можно вести в обычном приборе для вертикального электрофореза в трубках. Контроль за выходом ДНК из геля в мешочек удобно осуществлять с помощью бромистого этидия, введенного в состав буфера.
Вместо расплавления кусок агарозного геля можно залить расплавленной агарозой, как показано на рис. 40 [Case, Daneholti, 1976]. В стеклянную трубку с установленным внутри нее на не-
Рис. 40. Камера для электроэлюции ДНК из геля агарозы [Case, Daneholt,
1976]
/ — трубка; 2 — верхнее резиновое кольцо; 3 — кусочек геля агарозы; 4 — пробка; 5 — верхний электродный буфер; € — заливка агарозой; 7 — нижнее резиновое кольцо; 8 — камера элюции; 0 —диализная пленка; а — внесение кусочка геля на пробке в трубку; б — готовая к элюции система
Рис. 41. Двумерное фракционирование множества рестриктов ДНК животного происхождения в агарозном геле с помощью сорбции их на оксиапатите [Та-bak, Flavell, 1978]
а —колодец для контрольного препарата; б — колодцы, заполненные оксиапатитом; в — канавка для внесения исходного гидролизата ДНК
котором расстоянии от края резиновым кольцом снизу на рези-новой пробке вносят подлежащий элюции кусок агарозного геля. Сверху его заливают агарозой, расплавленной в таком же, как у рабочего геля, буфере. Затем пробку вынимают и агарозу закрепляют еще одним резиновым кольцом. На конец трубки надевают диализную мембрану, заполнив предварительно образующуюся таким образом камеру элюции буфером (в перевернутом положении трубки). В нормальном положении трубки буфер вносят над верхним резиновым кольцом, а затем всю систему включают в цепь прибора для вертикального электрофореза.
В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких полосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979]. На рабочий столик прибора устанавливают пластину 1%-ного геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кислот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вырезают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля. Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке рас-> полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно
каждого окна вплотную к его катодному краю. Доливают буфер в окна до уровня пластины агарозы и во избежание его испарения всю ее накрывают стеклом. Электроэлюцию ведут при силе тока 10 мА на холоду в течение 5—10 ч. Нуклеиновые кислоты выходят внутрь диализных мешочков, откуда их затем отсасывают вместе с буфером. Авторы метода указывают, что выход при этом составляет 50—70% для РНК и 70—90% для ДНК, а также подчеркивают чистоту и нативность получаемых таким образом препаратов.
