Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
От ДДСтЫа, часто необходимого для успешной элюции нуклеиновой кислоты, можно избавиться осаждением его в виде калиевой соли после добавления к экстракту концентрированного раствора КС1. Все осаждения производят с использованием микропробирок в настольных скоростных центрифугах («Ерреп-doif», «Beckman»).
Обычно вместе с нуклеиновыми кислотами переосаждается и низкополимерный, водорастворимый полиакриламид, выходящий вместе с ними из геля. От него можно избавиться осаждением нуклеиновой кислоты с помощью кислот (ТХУ, НСЮ4), однако целостность ее молекул при этом может пострадать. Если это неприемлемо, то для экстракции нуклеиновых кислот из геля следует применить буфер, содержащий 0,1—0,15 М NaCl, а затем из него осадить их добавлением цетавлона до 0,1%. Осадок це-тавлоновой соли нуклеиновой кислоты можно растворить энергичным встряхиванием в 20%-ном растворе ацетата калия, т. е. переводом ее в водорастворимую калиевую соль [Young Y., Young R., 1974]. Можно освобождаться от цетавлона растворением соли в крепких растворах NaCl с последующим осаждением этанолом и другими способами. Однако всегда следует иметь в виду, что нет способа проверить, полностью ли цетавлон вытеснен ионами металла из связи g нуклеиновой кислотой. Между тем в некоторых случаях, например для восстановления физиологической «компетентности» нуклеиновых кислот, примеси цетавлона могут создавать серьезные помехи.
Элюция из гелей агарозы
Для элюции ДНК из гелей агарозы предложен целый ряд методов, использующих особенности структуры этих гелей, а также возможность их растворения и плавления.
Выдавливание раствора ДНК из геля. Выше было указано, что гель агарозы представляет собой переплетение не сшитых между собой химически пучков нитей, образующих крупнопористую пространственную решетку. Такое своеобразие структуры позволяет осуществить, в частности, выдавливание жидкости из геля вместе с растворенной в ней ДНК. Эффективность этой операции повышается после замораживания геля, что, по-видимому, можно объяснить разрывами нитей растущими кристалликами льдз.
Так, срезы геля агарозы толщиной 3 мм можно заморозить при —20е, поместить между листками парафильма и сжимать пальцами в течение нескольких секунд — до 70% массы геля вытечет в виде жидкости. Для ускорения замораживания геля его можно подержать в течение 15 с в сухом льду, а потом выдержать при —20°. Не следует, однако, допускать охлаждения геля ниже указанной температуры. Под действием давления лед внутри геля плавится, подобно тому как плавится лед под коньками, и чем ниже температура, тем большее давление необходимо для его плавления. К остатку геля можно добавить еще 50 мкл буфера и сжатие повторить. Наконец, всю систему надо промыть
1 мл воды и агарозу удалить центрифугированием. Выход по ДНК составляет при этом около 70%. Показано, что ДНК с молекулярной массой до 50 млн. (как линейная, так и кольцевая) остается неповрежденной [Thuring et al., 1975].
Сжатие геля агарозы можно осуществить и центробежной силой. В этом случае процедура извлечения ДНК сводится к замораживанию и оттаиванию измельченного геля с последующим скоростным центрифугированием в бакет-роторе.
Относительно небольшие (устойчивые к действию срезывающих сил) молекулы ДНК можно извлечь из агарозы после энергичной гомогенизации геля (например, с помощью «Sorvall omnimixer») или после продавливания его через иглу шприца 26-го калибра. Обрывки нитей агарозы легко осаждаются центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Растворенная в буфере геля ДНК остается в супернатанте с выходом до 80%.
Растворение геля агарозы. Гели агарозы сравнительно легко растворяются в концентрированных водных растворах KI и Nal, а также в 5 М NaCIO*. Однако возникают определенные трудности в связи с необходимостью последующего разделения растворенных ДНК и агарозы.
В свежеприготовленном растворе, содержащем 1,3 г/мл KI, 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,5) и 1 мМ ЭДТА, гель агарозы полностью растворяется при 37° за 45 мин. Раствор можно нанести на колонку оксиапатита, уравновешенного 0,05 М Ыа-фосфатным буфером (pH 6,9), отмыть агарозу тем же буфером, а затем элюировать ДНК 1 М Na-фосфэтом. Затем, если надо, фосфат можно удалить путем диализа против 0,2 М. СН8СООК (pH 5) с 20 мМ ЭДТА, а ДНК осадить этанолом [Dodgson et al., 1979].
Сорбция и десорбция ДНК с оксиапатита приводят к нарушению целостности высокомолекулярных фрагментов ДНК, например рестриктов. Вогельстайн и Гиллеспи рекомендуют растворять гель агарозы, добавляя насыщенный водный раствор , Nal в соотношении 2: 1 к объему геля. Гель растворяется при комнатной температуре и осторожном встряхивании за несколько часов, а если допустимо энергичное встряхивание (с помощью прибора «Vortex»), то за несколько секунд. Из этого раствора ДНК можно избирательно осадить добавлением ‘/г объема ацетона. Осадок образуется при комнатной температуре за 1 ч. Его
можно собрать центрифугированием с ускорением 10000 g при
15° за 60 мин. Агароза остается в растворе, а осадок ДНК промывают 4 раза 75%-ным ацетоном и высушивают [Vogelstein, Gillespie, 1979].
