Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 68

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 130 >> Следующая

Зависимость расстояния миграции белков в этой системе от логарифма их молекулярной массы при электрофорезе в присутствии ДДС-Na тоже оказалась линейной. Для РНК эффект торможения наблюдался уже при концентрации акриламида 0,25%.
Важное преимущество системы заключается в том, что такой «гель» можно расплавлять и извлекать разделенные электрофорезом полосы из жидкости, кёк описано ниже для гелей агарозы.
ОКРАШИВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
В подавляющем большинстве случаев для окрашивания ДНК и РНК после электрофореза в ПААГ или гелях агарозы используют бромистый этидий — фенантреновый краситель, несущий положительный заряд и обладающий способностью внедряться в двунитевые участки нуклеиновых кислот между плоскостями соседних пар оснований.
Коэффициент молярной экстинкции бромистого этидия при 480 нм — 5800. Оптической плотности раствора при 480 нм, равной единице, отвечает его концентрация 70 мкг/мл. Бромистый этидий ограниченно растворим в воде. Его водные растворы флюоресцируют с максимумом при 590 нм. Существуют четыре оптимальных значения X для возбуждения флюоресценции (максимумы поглощения): 300, 336, 360 и 545 нм. Наиболее безопасно с точки зрения фотодеградации нуклеиновых кислот использовать для возбуждения А,=300 нм. Этой длине волны соответствует наибольшая длительность высвечивания, и при фотографировании в этом случае источник света можно погасить [Brunk, Simpson, 1977].
Флюоресценция резко усиливается при интеркаляции бромистого этидия в нуклеиновую кислоту, что и используется для окрашивания ДНК и двунитевых участков РНК. Однако бромистый этидий позволяет обнаружить и прису/с^твие однонитевых нуклеиновых кислот в геле. Это происходит за\ счет связывания и концентрирования красителя в результате его электростатического взаимодействия с остатками фосфорной кислоты.
Чувствительность метода обнаружения нуклеиновых кислот в гелях с помощью бромистого этидия очень высока: в гелях агарозы легко удается наблюдать полосы, содержащие 0,01 мкг ДНК, а в ПААГ —доли микрограмма. Рабочая концентрация водного раствора красителя при окрашивании нуклеиновых кислот в гелях составляет около 1 мкг/мл. В таком растворе гель вымачивают в течение 0,5—1 ч или же вводят бромистый этидий в рабочий буфер геля при его полимеризации.
Флюоресценцию наблюд&ют и фотографируют при освещении длинноволновым ультрафиолетовым светом (например, лампой М.-16 «Black Ray») с оранжевым светофильтром. Наилучщая
чувствительность отмечена при использовании пленок «Polaroid# типа 55 или 57. Отмывать гель после окрашивания не нужно, так как фоновая флюоресценция водного раствора красителя указанной концентрации мала. Если после элюции ДНК из геля бромистый этидий необходимо удалить, то это можно сделать хроматографией на колонке «Dowex 50» в 0,01 М Трис-HCl (pH 7,4) с 1 мМ ЭДТА.
Различить ДНК и РНК, находящиеся в одном геле, можно с помощью красителя «Stains-all», применение которого для окрашивания белков и гликопротеидов было описано в предыдущей главе. Там же были приведены рабочие концентрации этого красителя и условия окрашивания.
«Stains-all» окрашивает ДНК в синий, а РНК — в голубоватопурпурный цвет. Однако, как уже указывалось, чувствительность окрашивания невысока.
В числе красителей, использующихся в качестве лидирующих при электрофорезе белков в кислых буферных системах, был упомянут метиловый зеленый. Он специфически окрашивает ДНК, но не связывается с РНК. В недавней работе [Peters, Dah-mus, 1979] было описано использование метилового зеленого для определения концентрации ДНК в растворе в присутствии РНК. По-видимому, есть все основания предполагать, что с его помощью возможно обнаружение ДНК в геле в аналогичной ситуации. Чувствительность, разумеется, при этом должна быть намного ниже, чем для флюоресцентных красителей.
Впрочем, среди недавно появившихся флюоресцентных красителей есть и такой, который избирательно окрашивает ДНК в присутствии РНК,— 4,6-диамидино-2-фенилиидол-2НС1 (фирменное обозначение — DAPI). Краситель флюоресцирует при 454 нм, а оптимум возбуждения его флюоресценции находится при 372 нм. Он достаточно хорошо растворим в водных буферах. ПААГ или гели агарозы после электрофореза можно вымачивать в растворе DAPI (например: в 5 мМ трис-НС1, pH 7,2, с 0,01 М NaCl) в течение 1 ч, а затем отмыть фон тремя сменами воды в течение 3 ч. Рабочая концентрация красителя 0,1 мкг/мл. При этом он прочно связывается с ДНК, а РНК не окрашивает. Чувствительность окрашивания ДНК — того же порядка, что и у бромистого этидия [Kapuscinski, Yanagi, 1979].
Среди красителей, широко использовавшихся до недавнего времени для окрашивания РНК в ПААГ, можно, кроме «Stains-alb, назвать также акридиновый оранжевый, метиленовый синий, толуидиновый синий и пиронин. Все они обладают одним общим недостатком: окрашивание влечет за собой фотодеградацию молекул РНК. В тех случаях, когда этого необходимо избежать, например для последующей элюции РНК, окрашивать гель следует в темноте.
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed