Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Аналогичную систему двумерного электрофореза олигонуклеотидов (сначала по зарядам при pH 3,5, потом по размерам) можно использовать и после полного гидролиза РНК какой-либо специальной рибонуклеазой, например РНКазой Т1. Тогда совокупность фрагментов РНК, оканчивающихся гуанином, может служить для расшифровки последовательности этой РНК. В целях авторадиографического обнаружения и последующей элю-ции соответствующих пятен фрагменты в исходной смеси после гидролиза можно пометить радиоактивным фосфором по их 5'-концам с помощью 82Р-АТФ и полинуклеотидкиназы.
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЫЕ СЛУЧАИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Электрофорез в геле агарозы тройного комплекса ДНК — РНК-полимераза — РНК
Был провёден матричный синтез РНК с помощью РНК-поли~ меразы Е. coli. Один из рибонуклеозидтрифосфатов был радиоактивно меченным по фосфору. В качестве матриц использовали рестрикты ДНК (или ДНК «разрезали» рестриктазами после окончания синтеза РНК). Процесс транскрипции ограничивали по времени и концентрации трифосфатов таким образом* чтобы новосинтезированная меченая РНК содержала не более 100— 200 нуклеотидов. Тройной комплекс транскрипции подвергали электрофорезу в пластине 1,2%-ного геля агарозы размером
15X22X0,2 см. Буфер геля — обычный: 0,04 М Трис-ацетат
- (pH 7,9) с 0,02 М CHjCOONa и 1 мМ ЭДТА. Электрофорез вели в течение 8 ч при напряженности поля 4,5 В/см. Затем, окрашивая препарат бромистым этидием, наблюдали расположение в геле рестриктов ДНК, а с помощью авторадиографии выявляли те из них, на которых проходил синтез РНК. Таким образом можно было находить участки начала транскрипции и наблюдать за ее кинетикой [Chelm, Geiduschek, 1979].
Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы
В этом случае использовали гибридизацию поли (А)-последовательности мРНК в ходе самого электрофореза с полиуридило-вон кислотой, закрепленной на стекловолокнистом фильтре
Рис. 38. Вычленение мРНК из суммарного препарата при электрофорезе в геле агарозы с помощью стекловолокнистых фильтров с закрепленной на них поли-уридиловой кислотой [Egyhazi, Ossoinak, 1979]
1 — препарат; 2 — фильтр
GF/C [Egyhazi, Ossoinak, 1979]. Поли (У) фиксировали на фильтре ультрафиолетовым облучением. Для приготовления геля между пластинками формы размером 9X5X0,3 см, установленными вертикально, полимеризовали сначала небольшой слой 0,5%-ного геля агарозы, в котором с помощью выступов в одной из пластинок формировали два рядом расположенных колодца для препаратов шириной 10 мм и глубиной 2 мм каждый. Агарозу растворяли в 0,12 М NaCl с 0,03 М Трис-HCl (pH 7,5), 0,5% ДДС-Na и 2 мМ ЭДТА и заливали раствор до уровня на 1 мм выше выступов. Охлаждали форму, снимали одну из пластинок и на торец слоя агарозы против колодцев клали две полоски фильтров размером 3X11 мм (рис. 38). На одном из фильтров была закреплена полиуридиловая кислота, второй был свободен, и оба смачивались тем же буфером. Затем пластинку формы возвращали на свое место и поверх фильтров заливали и полимеризовали 1,25%-ный гель агарозы во всем объеме формы. Еще раз разобрав форму, пластину агарозы устанавливали в прибор для горизонтального электрофореза.
В колодцы вносили суммарный препарат РНК и начинали электрофорез, ограничив напряженность поля в течение первого
2
часа значением 1,6 В/см. За это время РНК выходила из колодцев и мигрировала сквозь фильтры. На том из них, где закреплена поли (У), задерживались все молекулы поли (А)-РНК. Рабочий буфер как раз и был выбран так, чтобы создать оптимальные условия для гибридизации поли(А)—поли(У). Через второй, свободный фильтр все РНК проходили без задержки. Затем фильтры вынимали, оставшиеся от них щели заливали агарозой и продолжали электрофорез в нормальных условиях до полного разделения всех прошедших через фильтры РНК. Далее методом авторадиографии сопоставляли две параллельные картины фракционирования. В треке РНК, прошедших через фильтр с поли (У), нехватало некоторого числа полос, по сравнению с соседним треком. Эти полосы, очевидно, и принадлежали молекулам поли (А)-РНК, которые таким образом выявлялись и фракционировались.
Использование жидкого (ие сшитого) ПААГ
В главе 1 уже отмечалось, что слабосшитый ПААГ не представляет собой жестко фиксированную пространственную решетку. Мигрирующие в таком геле макромолекулы раздвигают спутанные, но гибкие и на довольно протяженных участках свободные нити полиакриламида. Интересно было проверить эти представления на модели вовсе не сшитого полиакриламида.
Боде (Bode, 1977] проводил полимеризацию акриламида из его 7,5%-ного раствора в 0,1 М фосфатном буфере (без добавления метиленбисакриламида) с помощью обычных инициаторных добавок под вакуумом в течение ночи. Он получил очень вязкую жидкость, содержащую длинные и спутанные нити «линейного» полиакриламида. Эту жидкость он смешивал в различных пропорциях с расплавленным 1%-ным раствором агара. При охлаждении смесей получались достаточно прочные гели, в которых жесткая и крупнопористая пространственная сетка агара была заполнена полужидким линейным полиакриламидом. Эта система обеспечивала такое же хорошее электрофоретическое разделение белков, как и нормальный ПААГ с тем же содержанием акриламида. Правда, нижний конец трубки при этом приходилось закрывать диализной пленкой во избежание вытекания «геля».
