Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
.Так, Локард и соавторы разделяли продукты неполного гидролиза мРНК в первом направлении электрофорезом в пластинах (20X40X0,2 см) 10,5% -ного ПААГ (С=4,8), полимеризо-[ванного в 0,025 М лимонной кислоте (pH 3,5) с 7 М мочевиной. Электрофорез при напряженности поля 5 В/см вели до миграции $ромфенолового синего на расстояние 23 см для -анализа олигонуклеотидов короче 40 звеньев и на расстояние 33 см для более длинных фрагментов. Затем вырезали полоску геля шириной 1 см и длиной 16 см и зажимали ее между пластинками формы второго направления на расстоянии 1 см от ее нижнего края. Во втором направлении использовали 21%-ный ПААГ в 0,09 М Трис-боратном буфере (pH 8,3) с 7 М мочевиной. Этот гель по-лимеризовали в два этапа. Сначала его заливали до такого уровня, чтобы он едва покрывал полоску геля первого направления, и быстро полимеризовали, использовав повышенную концентрацию- персульфата аммония. Уплотнив таким образом низ формы, заливали и полимеризовали остальной гель. Электрофорез вели в направлении снизу вверх при напряженности поля
10 В/см. Для олигонуклеотидов, содержащих менее 40 мономер* ных звеньев, разделение заканчивали в тот момент, когда бром-феноловый синий опять мигрировал на 23 см, а для олигонуклеотидов длиной в 25—60 звеньев — когда ксиленцианол проходил расстояние в 27 см. Для более длинных олигомеров электрофорез вели до выхода ксиленцианола из геля [Lockard et al., 1978].
Привлекательной особенностью этого метода являётся возможность секвенирования нуклеотидных последовательностей путем анализа расположения пятен на пластине второго направления. Для этого, разумеется, необходимо, чтобы неполный гидролиз был неспецифичным и чтобы все сопоставляемые олигонук-леотидные фрагменты начинались с одного и того же конца, например с меченого 5'-конца исходной РНК (при условии, что пятна регистрируются авторадиографически). Иными словами, нужно располагать, как и в ранее рассмотренных методах секвенирования, полным набором фрагментов, отличающихся по длине на один нуклеотид.
Сдвиг соседних пятен во втором направлении будет примерно одинаковым для всех фрагментов, отличающихся на один нуклеотид, так как разделение в этом направлении происходит строго по размерам. Другое дело —в первом направлении. Здесь (при pH 3,5) присоединение к предыдущему фрагменту остатка уридиловой кислоты увеличивает его массу и одновременно привносит единичный отрицательный заряд. Таким образом, отношение суммарного заряда к массе почти не изменяется. Присоединение же цитидилового остатка только увеличивает массу, но заряда не вносит, так как отрицательный заряд фосфата компенсирован положительным зарядом основания. Очевидно, что фрагмент, удлиненный на «звено цитозина», будет при электрофорезе мигрировать медленнее, чем фрагмент, удлиненный на «звено урацила», хотя оба они будут отставать от неудлиненного фрагмента за счет возрастания трения о гель.
Аденин и гуанин занимают в этом отношении промежуточное положение (для Ц, А и Г величины р/Са равны соответственно 4,5, 4,2 и 3,2).
В результате конечная картина расположения пятен на пластине тоже напоминает лестницу, но уже не с перекладинами (полосками на треке), а как бы со ступенями. Каждое пятно отмечает одну ступень лестницы, и ему соответствует олигонуклеотид, отличающийся по длине от своих соседей на одно звено. В силу рассмотренных выше причин ступени этой лестницы окажутся одинаковой высоты, но различной ширины. Учитывая влияние на эту ширину присоединения каждого из нуклеотидов и переходя от ступени к ступени, можно расшифровать всю последовательность оснований в олигонуклеотиде.
Похожая в принципе система двумерного анализа нуклеотидной последовательности, где в первом направлении использовали электрофорез на ацетатцеллюлозе при pH 3,5, а во втором — тонкослойную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, полу-
чила образное наименование «Wandering spot analysis» («метод блуждающего пятна») [Silberklang et al., 1977].
Двумерный электрофорез в горизонтальной пластине агарозы недавно был использован для выявления скрытых разрывов в двунитевых фрагментах ДНК. В приборе Мак-Доннала с агарозными фитилями (см. рис. 14) сначала вели разделение смеси фрагментов по их размерам электрофорезом в 1,6%-ном геле агарозы, полимеризованной в нейтральном буфере. Препарат вносили в колодец, расположенный в углу пластины со стороны анода. На расстоянии 9,5 см разделялись фрагменты ДНК из хроматина, обработанного микрококковой нуклеазой, в интервале молекулярных масс от 50 тыс. до б млн. (по ДНК). По окончании разделения в первом направлении пластину вырезали, вымачивали в воде и в 0,03 М NaOH с 2 мМ ЭДТА (pH 12,3). Затем ее устанавливали снова в прибор, повернув на 90°, опять заливали фитили из 1%-ной агарозы и вели электрофорез во втором направлении в денатурирующих условиях («щелочная агароза»). Одинарные нити из целых двунитевых фрагментов располагались по диагонали, разделяясь, как и в первом направлении, по своим размерам. Скрытые разрывы двунитевой ДНК обнаруживались тем, что от пятен, лежащих на диагонали, в направлении анода тянулись «хвосты» более мелких обрывков нитей TModak, Beard, 1980].
