Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Джепесен в 1974 г. разделял рестрикты ДНК фага % и вируса SV-40 электрофорезом в линейном градиенте концентрации {2,5— 7,5%) ПААГ (С=9), образованном в пластинах размерами 12 X Х14 и 20X40 см при толщине геля 3 мм [Jeppesen, 1974]. Одновременно формировали градиент концентрации сахарозы (10— 20%) в буфере геля. Форму для геля заполняли через трубочку, опущенную до ее дна, так что более плотные слои раствора мономеров и сахарозы вытесняли менее плотные вверх. Заполнение начинали с чистого буфера (0,04 М Трис-ацетат, pH 8,3, +0,02 М CHsCOONa+2 мМ ЭДТА). Концентрация ТЕМЕД в смесителе градиентного устройства, содержавшем 2,5%-ный раствор мономеров, была почти в б раз выше, чем в резервуаре, поэтому полимеризация геля в пластине начиналась сверху (см. главу 2). Карманы для препаратов формировали в дополнительном стартовом геЛе (2,5%-ный ПААГ), полимеризованном
в том же буфере, но разбавленном в 5 раз. Препарат вносили в буфере, разбавленном еще вдвое. Необходимость'этих мер для предварительного концентрирования полос на г/анице рабочего геля, в котором создан градиент пористостиу представляется сомнительной. Электрофорез вели в течение 12—16 ч на холоду или 6—8 ч при комнатной температуре. Приведенные в работе фотографии (окрашивание 0,02%-ным метиленовым синим в темноте) впечатляют тонкостью полос разделенных рестриктов ДИК.
ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ кислот И ИХ ФРАГМЕНТОВ
Двумерный электрофорез полинуклеотидов не получил такого широкого распространения, как в случае белков, поскольку возможности воздействия на электрофоретическую подвижность изменением pH буфера геля ограничены. Нуклеиновые кислоты не поддаются и электрофокусированию, которое используется в одном из направлений столь эффективного разделения белков по О’Фарреллу. Тем не менее двумерное фракционирование нуклеиновых кислот можно вполне успешно использовать для разделения их по размерам, если воздействовать на вторичную и третичную структуры денатурирующими агентами.
Так, в работе [Garel et al., 1977] двумерным электрофорезом разделяли до 40 индивидуальных тРНК из суммарного препарата. В первом направлении (пластина 20X40X0,15 см) фракционирование вели в 9,6%-ном ПААГ, полимеризованном в обычном 0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,2) с 7 М мочевиной. Разделение происходило по длине молекул, полностью утративших свою вторичную структуру. Гель второго направления полиме-ризовали в таком же буфере, но мочевину добавляли лишь до концентрации 4 М. По-видимому, вторичная структура тРНК при этом частично восстанавливалась — в различной степени для разных индивидуальных тРНК. Концентрацию ПААГ во втором направлении соответственно увеличивали до 20%.
Тот же подход, но в упрощенном варианте, был использован несколько ранее [Varricchid, Ernst, 1975]. Здесь для разделения тРНК в обоих направлениях был использован практически один и тот же гель (15- и 16%-ный ПААГ), но в буфере первого направления присутствовала 7 М мочевина, а во втором направлении ее не было вовсе. Было получено 45 пятен тРНК.
В этих работах были использованы хорошо выраженные и качественно универсальные вторичная и третичная структуры транспортных РНК. Для мРНК нет достоверных общих данных по таким структурам, однако наличие многочисленных двунитевых «шпилек», по-видимому, является их широко распространенной, хотя и не обязательной особенностью. Этим обстоятельством удалось воспользоваться для выделения двумерным электро форезом гистоновых мРНК из множества других [Burckhardt, Birnstiel, 1978].
В первом управлении электрофорез бел# в трубках длиной
9 см и диаметрам 2,2 мм при умеренной температуре и в буфере обычной концентрации. Для электрофореза во втором направлении в пластине размером 9X17X0,2 см создавали комплекс денатурирующих условий: концентрацию буфера снижали в 20 раз, температуру повышали до 35° и, главное, вводили 5 М мочевину. Концентрация ПААГ в обоих направлениях была одинаковой (6%), как и напряженность электрического поля.
Оказалось, что только гистоновые мРНК расположились на диагонали, идущей под углом 45° к сторонам пластины. Иными словами, только они мигрировали во втором направлении с той же скоростью, что и в первом. Все остальные мРНК тоже выстроились в одну линию, но ее наклон указал на замедление миграции во втором направлении. Это замедление, по аналогии ¦с электрофорезом тРНК авторы приписывают денатурации и разворачиванию молекул. По их мнению, гистоновые мРНК либо с самого начала не имели вторичной структуры (шпилек), либо, наоборот, их вторичная структура выдерживала использованные денатурирующие воздействия. Эту трактовку трудно принять без дальнейших уточнений, так как молекулы РНК с торчащими из них жесткими шпильками должны, по-видимому, мигрировать в геле медленнее, а не быстрее, чем хаотические клубки денатурированных РНК. Аналогию с тРНК можно проводить только в том случае, если будет показано, что мРНК в нативном состоянии тоже обладают компактной третичной структурой.
Выше отмечалось, что для относительно коротких олигонуклеотидов электрофоретическая подвижность может зависеть от fpH буфера, особенно в кислой области pH, когда начинает сказываться вклад положительных зарядов цитозина и аденина. Этим обстоятельством можно воспользоваться для двумерного элекрофореза.
