Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 64

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 58 59 60 61 62 63 < 64 > 65 66 67 68 69 70 .. 130 >> Следующая

CH3HgOH
+Н1Ч
Бэйли и Дэвидсон для определения молекулярной массы РНК использовали электрофоре^ в денатурирующем 1%-ном геле агарозы, содержащем 5 мМ CHsHgOH. Aka розу расплавляли в боратном буфере (pH 8,2) в добавляли раствор гидроокиси метилртути. Ее вводили в той же концентрации и в раствор препарата, но> не в электродные буферы. После окончания электрофореза, перед окрашиванием бромистым этидием, гель вымачивали 30 мин в 0,5 М растворе ацетата' аммония. Аммоний связывает метилртуть, которая несколько мешает взаимодействию нуклеиновых кислот с бромистым этидием [Bailey, Davidson, 1976].
При подготовке ПААГ по обычной прописи гидроокись метилртути не следует вносить в раствор мономеров, так как она мешает полимеризации. Можно вводить CHsHgOH вымачиванием геля в соответствующем растворе, но можно и совсем обойти это затруднение. Было выяснено, что CH3HgOH мешает полимеризации ПААГ за счет взаимодействия с персульфатом аммония. Замена последнего на персульфат калия позволяет осуществить полимеризацию 8%-ного ПААГ в присутствии гидроокиси метилртути. Однако для получения такого же эффекта денатурации, как в агарозе, приходится заметно увеличивать концентрацию CH,HgOH — до 20 мМ для полной денатурации РНК. Неясно, происходит ли снижение денатурирующей способности за счет инактивации части молекул гидроокиси метилртути при. свободнорадикальной полимеризации ПААГ или она как-то связывается гелем.
Недавно [Maxwell et al., 1979] денатурирующий 1%-ный гель агарозы, содержащий 10,5 мМ CH3HgOH, был использован для исследования гетерологичности ядерных РНК и мРНК клеток животного происхождения. При напряженности электрического поля 3,3 В/см была обнаружена линейная зависимость расстояния миграции при электрофорезе от квадратного корня из величины молекулярной массы РНК вплоть до размеров порядка 45S. Более крупные молекулы РНК мигрируют аномально быстро в силу своей гибкости (см. выше).
Гидроокись метилртути значительно легче реагирует с имин-ными атомами азота урацила и тимина, чем с азотом гуанина, поэтому была исследована возможность использования неполной денатурации при пониженном содержании CHsHgOH в 1%-ном геле агарозы для фракционирования трудноразделимых РНК за счет различия их устойчивости к денатурации [Chandler et al.,
1979]. Такое фракционирование оказалось возможным. Авторам удалось, например, в присутствии 0,5 мМ CH3HgOH разделить рибосомальные 23S и 25S РНК, что иначе сделать не удается. После обработки 1,5 мМ раствором гидроокиси метилртути методом электрофореза были разделены 5S РНК из разных организмов (дрозофилы и Е. соН).
Для полноты картины отметим, что нуклеинрвые кислоты перед электрофорезом можно денатурировать и/обработкой глио-ксалем. При этом нет необходимости вносить/лиоксаль в гель И вообще создавать в нем денатурирующие условия, так как денатурация глиоксалем в обычных условиях необратима. Глиоксаль прочно присоединяется по двум атомам азота гуанина:
Денатурацию глиоксалем ведут в пластмассовых пробирках с крышками в 0,01 М растворе Ыа-фосфата (pH 7), содержащем 1 М глиоксаль в 50% -ном диметилсульфоксиде, при 50° в течение 1 ч [McMaster, Carmichael, 1977].
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГРАДИЕНТОВ ПОРИСТОСТИ ПААГ
Преимущества электрофореза в градиенте пористости (концентрации) ПААГ были отмечены в предыдущем разделе при обсуждении фракционирования белков. По-видимому, нет оснований предполагать, что эти преимущества не будут ощутимы и при фракционировании нуклеиновых кислот. Вероятно, лучших результатов можно ожидать в денатурирующих гелях, поскольку гибкость нитей нативных нуклеиновых кислот в обычных гелях может смазывать эффект торможения полос при уменьшении размера пор.
Широкого применения в последние годы электрофорез нуклеиновых кислот в градиенте пористости ПААГ не нашел, хотя в более ранних работах были получены многообещающие результаты.
Так, Миро и соавторы еще в 1971 г. в таком градиенте продемонстрировали очень хорошее разделение РНК из ядрышек HeLa в интервале размеров 18—45S. На приведенной в их работе электрофореграмме (рис. 37) видны острые пики и убедительное разделение таких близких по величине молекул, как предшественник рибосомальных РНК (45S) и промежуточная форма его процессинга (41S) [Mirault et al., 1971].
Для фракционирования РНП авторы той же работы использовали экспоненциальный градиент (2—6%) концентрации ПААГ (С=4,8). Электрофорез проводили в кварцевых трубках длиной 17 Ы. Во избежание конвекции при полимеризации одновременно создавали градиент концентрации глицерина (2,5—20%). Трубки заполняли сверху в наклонном положении. Для улучше-
Рис. 37. Разделение суммарной РНК из ядрышек HeLa электрофорезом 0 экспоненциальном градиенте концентрации ПААГ [Mirault et al., 1971]
ния смачивания стекла их предварительно споласкивали в 2%-ном водном растворе детергента Brij^35 и высушивали. То обстоятельство, что в нижней части трубки полимеризовался 6%-ный гель, позволило в верхней ее части иметь 2%-ный ПААГ без добавления агарозы. Для извлечения геля после окончания электрофореза трубки замораживали при —70°, потом быстро подогревали в горячей воде, чтобы успела подплавиться только наружная поверхность геля, и выталкивали его снова в ванну со смесью гексана с сухим льдом. Для геля и электродных резервуаров использовали один и тот же неденатурирующий буфер (0,04 М триэтаноламин+0,02 М CHsCOOMa+2 мМ ЭДТА; pH 7,4). Объем препарата мог быть большим, вплоть до 1 мл на трубку, так как полосы обострялись в ходе продвижения по градиентному гелю, как было описано выше для белков. Напряженность электрического поля 10 В/см.
Предыдущая << 1 .. 58 59 60 61 62 63 < 64 > 65 66 67 68 69 70 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed