Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Денатурирующие гели с формальдегидом
леновые мостики не образуются [Yaneva et ai., 1977]..В цитируемой работеХДААГ, полимеризованный в 0,02 М Na-фосфатном буфере (pH 7) с 3% формальдегида, использовали для определения молекулярных масс фрагментов ДНК. В таком геле имеет место линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы ДНК и расстоянием ее’миграции при электрофорезе. Использованный в этой работе 3%-ный (1 М) раствор формальдегида вполне обеспечивает денатурацию нуклеиновых кислот, хотя в последнее время нередко используют и вдвое большую концентрацию.
Ввиду его высокой концентрации формальдегид должен быть очень чистым. Достаточно очищен формальдегид фирмы «Ма1-linckroat». Следует работать со свежеприготовленным раствором формальдегида, без следов помутнения. Нейтрализовать раствор до pH 7 можно NaOH. Для приготовления денатурирующего геля на основе агарозы формальдегид добавляют к расплавленному водному раствору агарозы при 60° вместе с буфером.
В одной недавней работе [Rave et al., 1979] был описан электрофорез поли (А)-РНК в денатурирующем геле агарозы, содержащем 6% формальдегида в 0,04 М Na-фосфэтном буфере. РНК перед нанесением на гель денатурировали в 50%-ном растворе формамида с 6% формальдегида в том же буфере при 60° в течение 5 мин. Затем препарат быстро охлаждали и добавляли в него, как обычно, глицерин и бромфеноловый синий. В электродные резервуары заливали такой же буфер, содержащий 3% формальдегида. После окончания электрофореза гель вымачивали в течение 5 мин в воде при 60°. Этого было достаточно для снятия формальдегида с РНК, которую затем, после частичного щелочного гидролиза, переводили диффузией из геля на диазобумагу по методу Олвина [Alwine et al., 1977]. Несмотря на предшествующую обработку формальдегидом, поли (А)-РНК на диазобумаге успешно гибридизуется с ДНК.
В другой недавней работе [Schwinghamer, Shepherd, 1980] методом электрофореза определяли молекулярные массы меченной тритием РНК длиной 300^4000 нуклеотидов (0,1—1 млн. дальтон). Для этой дели использовали гель, содержащий 2,2% акриламида (С=4) и 0,5% агарозы, полимеризованный в 0,05 М Na-фосфэтном буфере (pH 7,2) с 5 мМ ЭДТА и 2,2 М (6,6%) формальдегида. Таким же буфером заполняли электродные резервуары. РНК предварительно денатурировали нагреванием при 60° в течение 10 мин в 50%-ном растворе формамида в 0,026 М Na-фосфатном буфере с 2,6 мМ ЭДТА и 2,2 М формальдегида. Электрофорез вели в пластинах размером 11Х14Х Х0,15 см в течение 17 ч при силе тока 17 мА; преэлектрофорез — при силе тока 25 мА в течение 1 ч,
Импрегнирование ППО для флюорографии в гель такого состава нельзя вести в чистом диметилсульфоксиде, так как гель разбухает. Непригоден и чистый метанол—в нем гель сжимается. Опытным путем подобрали смесь ДМСО с метанолом (4 : 1), в которой и растворяли ППО до концентрации 10%. Линейный график для определения молекулярной массы получали при построении зависимости квадратного корня из молекулярной дли-
ны РНК (числа нуклеотидов) от логарифма расс/ояния миграции в геле. /
Описан опыт совместного использования денатурирующих эффектов формамида {52%) и формальдегида (3%) для фракционирования РНК в геле, содержащем 1,6% акриламида и 0,6% агарозы [Lizardi, Engelberg, 1979]. Денатурирующие агенты вводили в 0,04 М триэтиламмониевом буфере (pH 7,5) с 1,3 мМ ЭДТА. Рабочая электропроводность буфера обеспечивалась миграцией ионов хлора из верхнего электродного буфера, содержавшего еще и 2,5 мМ NaCl.
Гели, содержащие гидроокись мети л ртути
Для приготовления гелей можно использовать продажный препарат гидроокиси метилртути (CHjHgOH) или получить это соединение из более доступного йодида метилртути CH3HgI (фирмы «Koch-Light»), как было описано еще в 1922 г. [Sneed, Maynard, 1922]. CHjHgOH должна хорошо растворяться в воде — плохо растворимые препараты непригодны. Это — сильнотоксичное и слегка летучее соединение. С концентрированными растворами следует манипулировать в вытяжном шкафу, крайне осторожно. В растворах с концентрацией менее 10 мМ гидроокись метилртути не очень опасна. Тем не менее даже над открытой горизонтальной пластиной агарозы, содержащей 10 мМ CHjHgOH, обнаруживается значительный уровень содержания паров ртути в воздухе.
Гидроокись метилртути присоединяется по азоту колец в ура-циле (тимине) и гуанине:
CH3Hg—+ Н20
Эти атомы азота участвуют в образовании водородных связей между нуклеиновыми основаниями, чем и объясняется дена-турирующий эффект гидроокиси метилртути. Эффект настолько силен, что CHjHgOH вводят в денатурирующий гель в концентрации 5—10 мМ. Гидроокись метилртути действует еще сильнее, чем формамид (некоторые ГЦ-богатые РНК не денатурируют и в чистом формамиде). Вместе с тем это соединение связывается с основаниями не очень прочно и легко снимается при вымачивании геля после электрофореза в 0,1 М растворе дитиотреито-ла. CHjHgOH сильно взаимодействует с аминами и сульфгид-рильными группами, поэтому нельзя для гелей, содержащих гидроокись метилртути, использовать аминосодержащие буферы, например Трис, а также вводить в гель (}-меркаптоэтанол. Из буфера геля следует исключить и ЭДТА, так как он образует с гидроокисью метилртути заряженный комплекс и таким образом способствует выходу ее из геля [Chandler et al., 1979].
