Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величина Т. Но это не всегда так; имеет смысл разобраться в этом глубже.
Неправильно было бы считать ПААГ регулярной пространственной решеткой с жесткими ячейками определенного среднего размера. При малых значениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние между этими точками вдоль нити (при С^2) в среднем равно 50—100 мономерных единиц. Такая система не может быть внутренне жесткой. Мигрирующие в геле макромолекулы, по-видимому, могут раздйигать гибкие длинные участки линейных полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энергия, миграция . молекул замедляется и происходит своеобразное «трение» их Ь гель. Однако жестких ограничений на размер
мигрирующих молекул такая система не накладывает! и это очень существенно. J
Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им), тем гуще нити полимера, меныне промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение .содержания «сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля так как средняя длина свободных участков нитей уменьшаете». Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в теле замедляется, — именно этого и можно было ожидать. Одйако далее картина меняется. Эксперимент обнаруживает, чтб с увеличением С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С>15 гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-ридимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, расположенным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономерных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным и вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка оказывается действительно жесткой — нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров.
Между прочим, такая же ситуация возникает и при затвердевании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями. Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание круп-нопористости и прочности, характерное для этих гелей.
Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень высоким содержанием метиленбисакриламида (С>15) хрупки, легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются. Этих недостатков лишены гели, сшитые NN'-диаллилтартардиа-мидом. Например, гель с Т=5 и С=15, сшитый ДАТД, оказывается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано успешное использование для электрофореза белков еще сильнее сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е. отношение акриламид/ДАТД не превышало 4: 1 [Spath, Koblet, 1979].
Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополимеров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении электрофоретической подвижности, заряжейяых макромолекул в Геле (и') ло сравнению с их подвижностью в свободной жидко-
стис такими же, как у буфера геля, значениями pH и ионной силы раствора (а,). Электроф&ретическую подвижность определяет как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч) при напряженности поля 1 В/см. Величина и0 зависит от соотношения суммарного электрического заряда макромолекулы (при данном рН)\и ее массы. Сила, действующая на молекулу в электрическом п<*ле, пропорциональна заряду, а противодействующая миграций*, вдоль силовых линий поля сила трения о жидкость пропорцйональна линейному размеру молекулы, а следовательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки заметим, что электрофоретическая подвижность большинства кислых белков в свободной жидкости при pH 8,8 лежит в пределах 0,1—0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между массой молекулы и величиной ы0» очевидно, быть не должно.
В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее, чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е. чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что имеет место соотношение: ln(u'/u0)=—kRT. Величина коэффициента торможения кя (порядка 0,1—0,4) зависит от среднего радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличиваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобулярных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина (М=12 400) до 3,61 нм для церулоплазмина (Af =151 ООО).
Для эффективного разделения белков при электрофорезе в ПААГ соотношение u'lut должно составлять 0,1—0,2. Отсюда следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность белков в ПААГ лежит в пределах 0,01—0,1 см/ч на 1 В/см. При напряженности поля 10—20 В/см этому соответствуют скорости миграции белков в диапазоне 0,1—2 см/ч. Таким образом, при рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентировки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения от них. Например, если заранее известно, что разделяемые белки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижностей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить время фракционирования в 2—3 раза.
