Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Еще раз подчеркнем, что в щелочную среду обязательно надо вносить достаточное количество ЭДТА (2—3 мМ) для того, что-
5 Л. А. Остермвн
129
10
8
Подвижность бромфенолового синего равна 9,5. Цифры у кривых — значения напряженности электрического поля, В/см.
Рис. 33. Зависимость относительной электрофоретической подвижности фрагментов линейной двунитевой ДНК фага Т7 от их длины [McDonnell et al., 1977]
Электрофорез в 1,6%-ном геле «щелочной агарозы»
О 0,2 0,5 1 2 5 10 20 50
Длина ДНК7 тыс. пар оснований
бы связать все остаточные Mg2+. В противном случае ионы магния «сшивают» нити нуклеиновых кислот и они даже могут выпадать в осадок.
Если исходный раствор нуклеиновых кислот был сильно за-буферен, его надо предварительно подтитровать щелочью. Бром-феноловый синий в щелочной среде постепенно обесцвечивается, поэтому его следует вносить в исходный препарат непосредственно перед началом электрофореза. Еще лучше в качестве лидирующего красителя в этом случае использовать бромфеноловый зеленый. Он устойчив к воздействию щелочи, а по электрофоретической подвижности сходен с бромфеноловым синим.
Как и для нативной ДНК, при выбранной пористости геля скорость миграции денатурированной ДНК в щелочной среде обновится независимой от молекулярной массы, если она превышает определенное значение. Это происходит тем раньше, чем мельче поры геля и чем выше напряженность электрического поля.
Из рис. 33 [Me Donell et al., 1977] можно видеть, что надежное разделение денатурированных ДНК по размеру в 1,6%-ном геле «щелочной» агарозы при напряженности электрического поля 10 В/см удается провести только для молекул с исходным размером (до денатурации), меньшим 2 КВР, т. е. с молекулярной массой менее 1,5 млн. При напряженности поля 0,5 В/см можно фракционировать и молекулы с исходной длиной 8 КВР, т. е. с молекулярной массой порядка 6 млн. дальтон. Молекулы ДНК короче 1 КВР разделятся при любой напряженности поля в рассматриваемом интервале ее значений.
В недавней работе [Andersson et al., 1979] 1,4%-ный гель агарозы полимеризовали в 0,03 М NaCl с 2 мМ ЭДТА, но в качестве верхнего электродного буфера использовали 0,03 М NaOH р*2 мМ ЭДТА. Ион ОН- мигрирует из электродного буфера в гель
быстрее, чем молекулы ДНК, и обеспечивает для них денатурирующие условия в геле. Фракционирование вели в течение 14— 16 ч при напряженности поля 2,2 В/см.
Электрофорез в щелочной среде, помимо оценки молекулярной массы, позволяет обнаружить однонитевые разрывы в исходных двунитевых структурах ДНК. Надо иметь в виду, что при сильнощелочных значениях pH остатки гуанина и тимина приобретают отрицательный заряд. Это надежно обеспечивает невозможность ренатурации ДНК, но может сказаться на соотношении электрофоретических подвижностей разных молекул ДНК или двух комплементарных нитей одной молекулы, особенно если размеры-этих молекул невелики и различия нуклеотидного состава не усредняются.
Гели, содержащие мочевину.
Секвенирование ДНК и РНК
Ввиду только что отмеченного обстоятельства разделение коротких олигонуклеотидов строго по их длине предпочитают вести в гелях, где фиксация однонитевого состояния нитей ДНК или РНК обеспечивается не щелочью, а присутствием высокой концентрации мочевины. Образуя прочные водородные связи с нуклеиновыми основаниями, мочевина препятствует их комплементарному спариванию. Сама по себе мочевина не распрямляет нити полинуклеотидов, но в отсутствие нейтрализации фосфатов ионами металлов эти нити оказываются достаточно расправленными для того, чтобы обеспечить надежное разделение олигонуклеотидов длиной в несколько сотен мономерных звеньев, отличающихся между собой всего лишь на одно звено. Именно такая задача стоит при использовании электрофореза в современных методах определения последовательности оснований («секвени-рования») в молекулах ДНК и РНК.
За последние годы предложено несколько подходов к секве-нированию нуклеиновых кислот. Подробное их рассмотрение здесь было бы неуместно. Тем не менее представляется целесообразным включить сюда хотя бы беглый очерк используемых для этой цели изящных и остроумных методов, выделяя при этом характерные особенности используемых в них приемов электрофореза.
Максам и Гильберт использовали для секвенирования меченные по 5'-концам радиоактивным фосфором одинарные нити денатурированных фрагментов ДНК [Maxam, Gilbert, 1977]. Были разработаны химические методы расщепления полидезоксирибо-нуклеотидов по заранее известным нуклеотидам. Концентрации реагентов и условия гидролиза подобрали так, что подавляющее большинство индивидуальных нитей случайным образом разрывалось только в одном из множества возможных мест. Все эти места равноправны. В результате при каждом методе обработки огромного множества нитей получали полный набор всех возмож-
ных фрагментов, длина 'каждого из которых определялась расстоянием одного из нуклеотидов (именно того, по которому идет расщепление при данном методе обработки) от меченого конца нити ДНК. Очевидно, что число таких фрагментов будет равно числу нуклеотидов данного вида в полинуклеотиде. Фактически пра каждом расщеплении получается два фрагмента, но радиоактивно меченным является только один из них, прилежащий к 5'-концу ДНК, а регистрируются только меченые фрагменты.
