Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Анализ размеров фрагментов ДНК в моно- и олигонуклеосо-мах после частичного переваривания хроматина микрококковой нуклеазой можно вести в мягких условиях и без предварительной депротеинизации ДНК. Недавно было показано, что добавление к такому хроматину до 0,4 % саркозила освобождает ДНК от связи с белком. Вместе с тем саркозил не вносит искажений в картину электрофореза ДНК (в отдичие от ДДС-Na, способного захватывать часть ДНК). На пластину геля можно вносить прямо всю инкубационную смесь, так как белки хроматина в комплексе с саркозилом не образуют четких полос и создаваемый ими фон лишь диффузно накладывается на резко очерченные полосы ДНК. Элетрофорез вели в 1,4%-ном геле агарозы
(0,04 М.Трис-HCl, pH 7,9, +5 мМ CHsCOONa + l мМ ЭДТА+ + 0,1 мкг/мл бромистого этидия). Можно использовать и 3,5%-ный ПААГ в обычном 0,09 М Трис-боратном буфере, pH 8,3 [Creusot, Christman, 1980]. Такой же подход возможен для освобождения и электрофореза РНК из рибосом.
Фракционирование РНК
В классической работе Пикока и Дингмэн нативные РНК от тРНК До 30 S РНК рибосом печени фракционировали в смешанных гелях, содержащих от 1,5 до 3% ПААГ (Ci=5) и 0,5% агарозы [Peacock, Dingman, 1968]. Рабочий буфер геля — все тот же 0,09 М Трис-борат (pH 8,3) с 3 мМ ЭДТА, электродные буферы разбавлены в 10 раз. Для гелей с различным содержанием акриламида электрофоретические подвижности соответствующих РНК заметно отличались друг от друга, но во всех случаях для данного геля имела место обратная линейная зависимость расстояния миграции молекул РНК от логарифма их молекулярной массы. Эта зависимость сохранялась в интервале молекулярных масс от 20 тыс. до 2 млн. дальтон.
Шуерх и соавторы обнаружили, что оптимальное фракционирование двунитевых РНК реовируса в интервале молекулярных д^сс от 0,3 до 3 млн. получается в 7,5%-ном ПААГ (С=2,6). Однонитевые РНК в том же диапазоне молекулярных масс лучше разделять в смешанном геле (1,8%-ный ПААГ с 0,6% агарозы и добавлением мочевины до 6 М) [Schuerch et al., 1975]. В последнем случае электрофорез приходилось вести в трубках из стекла «Perspex», вымоченных в течение ночи в 1%-ном ДДС-Na и промытых перед использованием стерильной водой (лишенной РНКаз), так как обычное стекло плохо сцепляется с гелем столь малой концентрации.
Фракционирование РНК с молекулярной массой до 15 млн. удается успешно проводить в слабосшитом 2,2%-ном ПААГ (С=2) [Shaaya, 1976]. В свете отмеченной выше трудности миграции РНК в геле из-за наличия в них «шпилек» этот успех можно связать с увеличением возможности раздвигания слабо-сшитых нитей акриламида (см. главу 1). Манипулировать с таким гелем нелегко, но возможно.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ДЕНАТУРИРУЮЩИХ ГЕЛЯХ
Как следует из изложенного, фракционирование нативных, двунитевых молекул ДНК по'размерам с помощью электрофореза в гелях агарозы возможно, но до определенных значений их молекулярной массы. Фракционирование нативных высокополимерных РНК затруднено наличием двунитевых «шпилек» и неопределенностью их числа и размеров. Выше шла речь об электрофорезе денатурированных молекул ДНК в мягких условиях, в нейтральной области pH рабочих буферов. При этом однони-
тевые структуры могут сохраниться в ходе электрофореза только при условии их очень малой концентрации. В противном случае происходит частичная ренатурация этих молекул. Кроме того, однонитевые фрагменты ДНК и РНК даже при малой концентрации в мягких условиях электрофореза удается разделить относительно грубо—лишь при значительном различии их молекулярных масс. Это связано с не поддающимся учету влиянием фактора гибкости одиночных нитей, их способностью свертываться в клубки, а также с возможностью существования в них локальных двунитевых участков. Такие участки могут иметь нативное происхождение (палиндромы ДНК, «шпильки» РНК) или возникать случайным образом при наличии более или менее комплементарных последовательностей нуклеиновых оснований в составе одной гибкой нити.
Воспроизводимое фракционирование однонитевых молекул ДНК и РНК, а также определение их молекулярной массы по скорости миграции в геле оказываются возможными только при сохранении условий денатурации в ходе самого электрофореза. Поэтому во всех случаях, когда нет необходимости сохранить нативную структуру, нуклеиновые кислоты предпочитают фракционировать электрофорезом в денатурирующих условиях, или, как говорят, в «денатурирующих» гелях. Это означает, что внутри геля создается среда, препятствующая комплементарному спариванию одинарных нитей нуклеиновых кислот или их участков.
В некоторых случаях эта среда способствует распрямлению нитей, что делает зависимость скоростей миграции от значений длины полинуклеотидов более строгой, обеспечивает возможность их тонкого фракционирования и оценки молекулярной массы (сопоставлением с маркерами). Рассмотрим различные варианты электрофореза в денатурирующих гелях и их использование.
Щелочные гели
Уже отмечалось, что вместо буфера в ПААГ и гелях агарозы можно использовать разбавленные водные растворы щелочи (0,02—0,03 М NaOH). Полимеризация акриламида в щелочной среде идет вполне успешно, но требует примерно трехкратного увеличения концентрации персульфата аммония и соответственно ТЕМЕД. На застывании раствора агарозы присутствие щелочи не сказывается. В щелочной среде благодаря электростатическому отталкиванию остатков фосфорной кислоты однонитевые ДНК и РНК не свертываются в клубки, а мигрируют в виде расправленных нитей. Жесткость таких нитей тем больше, чем они короче, подобно тому как это имеет место и для двунитевых молекул. При этом и скорость миграции однонитевых молекул оказывается приблизительно такой же, как у двунитевых, нативных молекул той же длины.
